国家质检总局科技计划项目(2007IK023)
- 作品数：7 被引量：36H指数：4
- 相关作者：季新成段晓东牛国辉于学辉员丽娟更多>>
- 相关机构：新疆出入境检验检疫局新疆大学西北农林科技大学更多>>
- 发文基金：国家质检总局科技计划项目更多>>
- 相关领域：农业科学更多>>
- 牛精液中IBRV荧光PCR检测方法的建立及精液带毒与血清抗体的关系被引量：1
- 2010年
- 【目的】建立牛精液中牛传染性鼻气管炎病毒（IBRV）的荧光PCR检测方法,并分析精液带毒与血清抗体的关系,为牛精液中IBRV的荧光PCR诊断和判定提供技术依据。【方法】采用Sephycral S-400凝胶过滤法和蛋白酶K预消化法,分别对新鲜牛精液和冻存牛精液进行处理,用DNA Zol方法提取病毒核酸,通过PCR反应条件的优化,建立了牛精液中直接检测IBRV的荧光PCR方法,对该方法进行特异性和重复性检验;最后用该方法分别对120份新鲜牛精液和40份冻存牛精液进行检测,同时用普通PCR方法和病毒分离方法加以对比;并对其中的10头牛定期采集精液、鼻腔拭子和血清样品,用该荧光PCR方法进行病原检测,对血清样品进行IBRV抗体检测。【结果】建立的荧光PCR方法具有较好的特异性,重复性和稳定性很好。用该方法可检测到新鲜牛精液中0.002 TCID50的病毒粒子,检测到冻存牛精液中0.02 TCID50的病毒粒子,检测时间在3 h之内,是OIE已报道方法灵敏度的40～400倍,是病毒分离方法灵敏度的100倍。120份新鲜牛精液和40份冻存牛精液中,检测到阳性样品25份,用普通PCR检测得到阳性样品15份,病毒分离检测得到阳性样品12份。检测结果表明,精液为阳性的牛血清抗体不一定为阳性,血清抗体阳性的牛精液中也不一定携带病毒。【结论】建立了牛精液中IBRV的荧光PCR检测方法;通过分析精液带毒与血清抗体的关系,进一步表明不能简单地以血清抗体阴阳性作为精液是否带毒的依据。鼻腔拭子带毒具有间歇性。
- 季新成牛国辉员丽娟段晓东张彦明于学辉曾新强
- 关键词：牛传染性鼻气管炎病毒荧光PCR血清抗体
- 牛精液中基因I型牛病毒性腹泻病毒荧光探针定量RT-PCR检测方法的建立被引量：3
- 2011年
- 为建立牛精液中基因I型牛病毒性腹泻病毒(BVDV-1)的快速检测方法,本研究采用Sephycral S-400凝胶对牛精液过滤处理后提取病毒核酸,根据BVDV-1 5'UTR保守区基因序列,设计特异性引物和荧光探针,通过反应条件的优化,建立了牛精液中BVDV-1荧光定量RT-PCR检测方法。该方法可以检测到牛精液中含量为0.0125 TCID50的病毒,灵敏度比病毒分离方法高200倍～2 000倍,比常规RT-PCR方法高10倍。对从同一个牛场6个月内采集的120份新鲜牛精液和40份冷冻牛精液用该荧光RT-PCR方法检测,没有检测到BVDV-1阳性样品。对其中的10头牛定期检测精液中病毒的同时,并同步检测了全血中的病毒和血清抗体,结果血清抗体阳性牛精液中没有检测到病毒,本研究结果表明,不能以血清抗体阴阳性做为精液是否带毒的依据。
- 季新成黄玲段晓东员丽娟牛国辉于学辉曾新强张彦明
- 关键词：牛精液荧光定量RT-PCR检测血清抗体检测
- 牛传染性鼻气管炎病毒血清抗体检测试验及结果分析被引量：7
- 2008年
- 采用SYNBIOTICS公司酶联免疫吸附试验(ELISA)检测试剂盒对来自新疆15个不同地区(包括4个养牛场)共635份牛血清进行了牛传染性鼻气管炎病毒血清抗体检测,共检出阳性血清329份,最高感染率达90%,最低感染率为5%,平均感染率为51.8%,结果显示该病已在全疆普遍存在,感染没有明确的地域分布规律。对其中的106份血清用Institute Pourquier公司ELISA试剂盒重新检测,发现两试剂盒的符合率为90.6%,Institute Pourquier公司ELISA检测试剂盒敏感性稍高。从该106份血清中再次随机抽取其中的35份用病毒中和实验(VN)检测方法进行了检测,检测结果与SYNBIOTICS公司ELISA检测试剂盒相比较,同为阳性样品24份,同为阴性样品7份,两者符合率88.6%;与Institute Pourquier公司ELISA检测试剂盒相比较,同为阳性样品24份,同为阴性样品6份,两者符合率85.7%。试验结果表明,与VN相比,ELISA检测试剂盒具有操作简便,敏感性高等优点。
- 季新成王振宝王文陈新民刘晓晖王陆宝
- 关键词：牛传染性鼻气管炎血清抗体ELISA流行病学
- 牛病毒性腹泻病毒不同检测方法的比较研究被引量：11
- 2009年
- 采用Idexx公司抗原捕获ELISA试剂盒对新疆部分地区160份牛血清进行了牛病毒性腹泻病毒抗原检测,结果有6份样品为阳性,对该6份血清用BVDV阴性血清进行了系列稀释后,分别用抗原捕获ELISA、RT-PCR和荧光RT-PCR进行检测,发现RT-PCR方法比ELISA检测灵敏度高10-100倍,荧光RT-PCR比RT-PCR灵敏度高约10-100倍。
- 季新成曾新强员丽娟牛国辉于学辉段晓东王大孝
- 关键词：牛病毒性腹泻病毒RT-PCR荧光RT-PCR
- 牛病毒性腹泻病毒的分离与鉴定被引量：11
- 2010年
- 【目的】为了解牛病毒性腹泻/黏膜病在新疆的流行现状,对疑似该病病料进行地方毒株的分离,并对其进行鉴定。【方法】将采自新疆不同地区疑似牛病毒性腹泻的病料接种MDBK细胞,并盲传2-4代;对分离株进行毒力测定及中和试验,应用RT-PCR方法扩增分离株的5’UTR基因片段并克隆测序分析。【结果】分离到的8株病毒可发生细胞病变,在MDBK细胞上的TCID50为103-106。毒株血清中和实验结果,RT-PCR反应结果,克隆后重组质粒经BamHI、HindIII双酶切鉴定、重组质粒PCR鉴定结果均得到预计扩增片段。重组质粒测序结果与GenBank中已发表的牛病毒性腹泻病毒NADL株序列同源性为82.0%-94.8%。【结论】证实所分离到的病毒为BVDV,命名为B-S-1、B-S-2、B-S-3、B-S-4、B-S-5、B-S-6、B-G-1和B-G-2。
- 牛国辉季新成段晓东晁群芳
- 关键词：牛病毒性腹泻病毒血清中和试验RT-PCR基因序列分析
- Taq Man探针荧光定量RT-PCR对牛精液中牛病毒性腹泻病毒检测方法的建立
- 2010年
- 季新成段晓东刘菲刘小兰于学辉曾新强
- 关键词：牛病毒性腹泻病毒荧光定量RT-PCR牛精液TAQ病毒性传染病
- 牛传染性鼻气管炎病毒内标荧光定量PCR检测方法的建立与应用被引量：6
- 2010年
- 根据牛疱疹病毒1型(BHV1)gB基因序列,设计高度保守的引物和荧光探针,并扩增包含有荧光PCR扩增区域的核酸片段,通过凝胶纯化回收,将该片段克隆至pMD18-T载体,经鉴定后获得目标模板。通过碱基重排和引物设计,用搭桥法PCR扩增,获得BHV1荧光定量PCR内标模板。对内标模板的添加量和反应条件进行优化,建立了含有内标物的荧光定量PCR检测体系。该体系可以检测到10个拷贝/PCR反应的重组质粒,对BHV1可检测到0.01TCID50的病毒粒子,灵敏度比常规PCR和病毒分离高10～100倍,与不加内标的荧光PCR检测灵敏度相当。更重要的是,内标模板可以对反应体系进行监测,指示并校正假阴性结果,从而达到提高PCR检测准确率的目的。对临床收集的40份牛精液(其中8份已经鉴定为阳性)和10份牛鼻腔拭子(其中2份已经鉴定为阳性)用该体系进行检测,均得到预期结果。该方法的建立可用来对临床样品中BHV1的快速检测和实验室的质量控制。
- 季新成牛国辉员丽娟张彦明李鹏段晓东于学辉
- 关键词：牛传染性鼻气管炎病毒荧光定量PCR内标
