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缬沙坦对大鼠颈动脉球囊损伤后血管内膜增生和TLR4表达的影响被引量：1: 2010年; 目的:观察缬沙坦对大鼠颈动脉球囊损伤后血管内膜增生及Toll样受体4(toll like receptor4,TLR4)表达的影响。方法:以1.5F球囊导管建立大鼠颈动脉球囊损伤模型,SD大鼠随机分为假手术组(n=6)、球囊损伤组(n=12)、缬沙坦组(n=12)。造模后第1天开始给予缬沙坦10mg.kg-1.d-1灌胃,假手术组及球囊损伤组灌胃等量蒸馏水,14d后取损伤血管段,组织形态学观察并测定内膜增生情况,实时定量PCR检测血管TLR4mRNA的表达。结果:术后14d,球囊损伤组和缬沙坦组可见明显内膜增生,内膜面积及内膜和中膜面积比均显著大于假手术组,而缬沙坦组上述指标均低于球囊损伤组(P<0.05);球囊损伤组和缬沙坦组TLR4mRNA的表达较假手术组升高,与球囊损伤组比较,缬沙坦可降低球囊损伤诱导的TLR4高表达。结论:缬沙坦可抑制大鼠颈动脉球囊损伤引起的血管内膜增生,其作用可能是通过下调损伤血管TLR4的过表达而实现。; 杨简江洪陈思思徐盛开王继春; 关键词：内膜增生球囊损伤 TOLL样受体4

大鼠CREB结合蛋白RNA干扰重组慢病毒载体的构建与鉴定: 2010年; 目盼构建大鼠CREB结合蛋白（CREB binding protein，CBP）基因RNA干扰（RNAi）慢病毒载体，并观察该载体对大鼠血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）CBP表达的沉默效应。方法设计合成4条CBP基因的siRNA序列，将筛选确定的CBP RNAi有效靶序列与pFU—GW—iRNA载体连接产生CBPshRNA慢病毒表达载体，转化、PCR筛选阳性克隆及测序鉴定。脂质体2000将CBP shRNA慢病毒载体和慢病毒包装质粒共转染293T细胞，完成慢病毒颗粒包装及滴度测定。包装产生的重组慢病毒感染大鼠VSMCs，实时定量RT-PCR检测CBP mRNA的表达，并与未转染及转染阴性对照shRNA慢病毒的细胞进行比较。结果PCR扩增和测序结果证实，成功构建大鼠CBP shRNA慢病毒载体。经包装产生的慢病毒滴度为2×10^9TU／ml，与未转染慢病毒及转染阴性对照shRNA慢病毒的细胞比较，CBP shRNA慢病毒转染可使VsMcs的CBP mRNA分别下降88．5％和92．7％。结论成功构建CBP基因RNAi慢病毒表达载体．对VsMcs的CBP表达具有良好沉默作用，为后期基因治疗血管增殖性疾病奠定基础。; 杨简江洪陈思思陈静徐盛开王继春; 关键词：RNA干扰转染基因疗法

携带CBP短发夹RNA基因腺病毒表达载体的构建: 2011年; 目的:构建编码4条大鼠CREB结合蛋白(rCBP)短发夹RNA(shRNA)的腺病毒,检测RNA干扰技术(RNAi)下调rCBP mRNA的能力。方法:根据RNAi原理,设计4条针对rCBP的shRNA序列。PCR技术和酶切连接技术构建重组穿梭质粒Pgenesil4-rCBP-EGFP;体外同源重组技术构建可同时编码4条rCBP shRNA的腺病毒(CBP-shRNA/Ad),并进行鉴定和滴度检测。荧光显微镜观察CBP-shRNA/Ad转染大鼠血管平滑肌细胞(VSMCs)效率,RT-PCR技术和实时定量PCR技术检测CBP-shRNA/Ad下调rCBP mRNA的能力。结果:经酶切鉴定和质粒测序证实CBP-shRNA/Ad构建成功。荧光显微镜下观察,感染复数为25的CBP-shRNA/Ad转染VSMCs效率达80%,并且细胞生长良好。相同剂量的CBP-shRNA/Ad转染VSMCs 24 h、48 h、72 h,rCBP mRNA含量持续下降(P<0.05),并且72 h时rCBP mRNA含量低于空白对照组(P<0.05)。结论:CBP-shRNA/Ad可明显下调rCBP mRNA含量,对VSMCs无明显毒副作用,为基因治疗血管增殖性疾病奠定初步实验基础。; 魏云杰江洪陈静张静徐昌武; 关键词：RNA干扰腺病毒血管平滑肌细胞

基质细胞衍生因子预处理的内皮祖细胞对大鼠急性心肌梗死的治疗作用被引量：1: 2009年; 目的探讨基质细胞衍生因子（stromal cell-derived factor-1，SDF-1）预处理的内皮祖细胞（endothelial progenitor cells，EPCs）对大鼠急性心肌梗死的治疗作用。方法培养大鼠骨髓来源的内皮祖细胞，检测SDF-1在体外对EPCs迁移和存活能力的影响。建立大鼠急性心肌梗死模型，随机分为SDF-1＋EPCs组、EPCs组和对照组，每组12只。心梗后24h，将SDF-1预处理或未处理的EPCs经尾静脉注入动物体内，对照组注射不含细胞的培养基。细胞输注后的14d和28d，分别检测血管密度、心功能及心肌梗死面积等指标。结果细胞输注后14d，SDF-1＋EPCs组血管密度高于EPCs组及对照组。细胞输注后28d，SDF-1＋EPCs组大部分心功能指标优于EPCs组和对照组，心梗面积低于EPCs组和对照组。结论SDF-1预处理能促进EPCs的迁移和存活，促进体内EPCs介导的新血管生成，减少心肌梗死面积，促进心功能的恢复。; 王朗江洪陈思思张元元朱丽华; 关键词：基质细胞衍生因子内皮祖细胞急性心肌梗死预处理

慢病毒载体在大鼠颈动脉球囊损伤模型中的应用及观察被引量：4: 2010年; 目的:研究携带绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein,GFP)的慢病毒转染球囊损伤大鼠颈动脉的效率和可行性,为利用慢病毒载体介导的基因治疗预防血管再狭窄奠定基础。方法:将携带GFP的慢病毒载体(pGC-LV-GFP载体)和慢病毒包装质粒供转染293T细胞,完成慢病毒颗粒包装及滴度测定。包装产生的慢病毒Lenti-GFP转染至球囊损伤的大鼠颈动脉。术后28d,损伤及病毒转染血管段标本分别行荧光显微镜、光镜检查,评估慢病毒的转染效率及内膜增生情况,并与假手术组(Sham组)、PBS对照组进行比较。结果:经包装产生的Lenti-GFP滴度为2×109TU/mL;术后28d,Sham组与PBS组血管中膜弹力层仅见微弱的自发性绿色荧光,而Lenti-GFP组动脉壁全层可见较强的绿色荧光分布;PBS组与Lenti-GFP转染组大鼠损伤的颈动脉均可见明显内膜增生,内膜和中膜面积之比差异无统计学意义。结论:Lenti-GFP成功转染至球囊损伤的大鼠颈动脉,并能维持目的基因稳定长期的表达,是血管再狭窄基因治疗的理想载体。; 杨简江洪李万强陈思思陈静徐盛开王继春; 关键词：慢病毒载体颈动脉损伤基因治疗再狭窄

CBP基因沉默抑制血管平滑肌细胞增殖的研究: 2011年; 目的:探讨RNA干扰大鼠CREB结合蛋白(rCBP)基因对大鼠血管平滑肌细胞(VSMCs)增殖的影响。方法:根据CBP cDNA序列构建可同时表达4条针对rCBP mRNA特异的短发夹RNA(shR-NA)、携带绿色荧光蛋白的腺病毒(CBP-shRNA/Ad)。以空腺病毒为转染对照组、含非特异性shRNA编码序列的腺病毒为阴性对照组、感染复数为12、16、25、50的CBP-shRNA/Ad为干预组,转染0.1 U/mL凝血酶预处理的VSMCs 2 d。RT-PCR法、蛋白印记法分别检测rCBP mRNA和蛋白质的表达变化。流式细胞技术检测细胞周期,评价细胞增殖能力。倒置显微镜观察CBP-shRNA/Ad对细胞的毒副作用。结果:不同剂量的CBP-shRNA/Ad可在mRNA和蛋白质水平,明显抑制凝血酶诱导CBP高表达(P<0.05),具有量效依赖性。CBP-shRNA/Ad通过下调CBP含量,可使G0/G1期细胞比例显著升高(P<0.05),S期细胞比例下降(P<0.05),细胞周期被阻滞。倒置显微镜观察细胞贴壁状况良好。结论:RNA干扰技术可通过选择性下调rCBP的表达,显著抑制VSMCs的增殖,无明显细胞毒性。; 魏云杰江洪陈静张静徐昌武; 关键词：血管平滑肌细胞 RNA干扰基因治疗

高糖对内皮祖细胞增殖、凋亡的影响及与氧化应激的关系被引量：3: 2012年; 目的:探讨高糖对内皮祖细胞增殖、凋亡的影响及与氧化应激的关系。方法:分离培养、鉴定SD大鼠骨髓内皮祖细胞,分为正常组和高糖组(30mmol/L),MTT法检测增殖能力,Annexin-V/PI双染法检测凋亡率,荧光分光光度计检测活性氧的含量,酶标仪检测超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶的活性。结果:与正常组相比,高糖组内皮祖细胞增殖能力降低,凋亡率增加,活性氧含量升高,超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶活性降低(P<0.05)。结论:高糖可抑制内皮祖细胞的增殖能力,促进其凋亡,其机制可能与高糖抑制内皮祖细胞中超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶的活性,诱导活性氧生成增加有关。; 刘佳江洪于志明苏钰任伟朱丽华王朗; 关键词：高糖内皮祖细胞增殖凋亡氧化应激

CBP基因沉默对大鼠颈动脉球囊损伤后内膜增生的影响被引量：1: 2013年; 目的观察小干扰RNA(siRNA)重组慢病毒介导的CREB结合蛋白(CBP)基因沉默对大鼠颈动脉球囊损伤后新生内膜增生的影响,并探讨其作用机制。方法雄性SD大鼠48只,随机分为4组:假手术组、PBS对照组、慢病毒介导CBP基因siRNA转染组(CBP-siRNA-Lenti组)及慢病毒介导非CBP同源序列siRNA转染组(NC-siRNA-Lenti组),建立大鼠颈动脉球囊损伤模型,术后28天处死动物。分别用实时定量PCR、Western Blot检测大鼠颈动脉CBP和乙酰化核因子κB p65(NF-κB p65)的表达水平;病理组织学观察血管内膜增生情况;免疫组织化学染色对损伤血管壁增殖细胞核抗原(PCNA)的表达进行评估。结果术后28天,与PBS对照组和NC-siRNA-Lenti组比较,CBP-siRNA-Lenti组CBP mRNA和蛋白的表达显著下调(P均<0.05),CBP沉默能明显抑制新生内膜面积(0.108±0.008 mm2比0.238±0.022 mm2、0.252±0.016 mm2,P<0.05)、内膜与中膜面积比(0.706±0.062比1.483±0.136、1.497±0.137,P<0.05)的增加,及下调血管壁乙酰化NF-κB p65和PCNA的表达水平(P均<0.05)。结论慢病毒介导的CBP基因沉默能有效地抑制颈动脉球囊损伤后新生内膜的形成,其机制可能与抑制NF-κB p65的过度乙酰化有关。; 杨简江洪杨俊丁家望李松陈静; 关键词：基因沉默内膜增生核因子ΚB

凝血酶对骨髓来源内皮祖细胞增殖能力的影响被引量：4: 2010年; 目的:观察凝血酶对骨髓来源内皮祖细胞(EPCs)增殖能力的影响并探讨其机制。方法:密度梯度离心法从大鼠骨髓分离EPCs,培养7 d后收集贴壁细胞并加入不同浓度凝血酶(10-2,10-1,1,10,100 U/mL)干预一定时间(6,12,24,48 h)。CCK-8试剂盒检测EPCs增殖。实时定量PCR检测凝血酶刺激以及NF-κB抑制剂预处理以后EPCs的VEGF mRNA表达变化,ELISA法检测其分泌量变化。结果:凝血酶干预组的细胞增殖数均高于对照组,10 U/mL凝血酶作用24 h对内皮祖细胞数量影响最为显著(P<0.05)。与对照组相比,凝血酶刺激后VEGFmRNA表达及分泌量均增高,使用NF-κB抑制剂预处理后可以抑制凝血酶的这种作用。结论:凝血酶可以通过NF-κKB途径上调VEGF的表达,促进EPCs增殖。; 陈思思江洪陈静杨简何勃; 关键词：内皮祖细胞细胞增殖凝血酶骨髓

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国家自然科学基金(30770849)

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