国家自然科学基金(81300349) 作品数:10 被引量:53 H指数:3 相关作者: 段钟平 时红波 任锋 陈煜 陈德喜 更多>> 相关机构: 首都医科大学附属北京佑安医院 山西医科大学 枣阳市第一人民医院 更多>> 发文基金: 国家自然科学基金 北京市科技新星计划 北京市自然科学基金 更多>> 相关领域: 医药卫生 文化科学 更多>>
肝再生增强因子通过增加自噬水平促进CCl4诱导的急性肝损伤中HL-7702细胞的增殖 被引量:2 2016年 目的研究肝再生增强因子(ALR)保护急性肝损伤的作用及其机制。方法HL-7702细胞分为正常对照组、CCl4急性肝损伤组、ALR+CCl4干预组、3-甲基腺嘌呤(3-MA)+CCl4干预组以及ALR+3-MA+CCl4干预组,CCl4处理前8h对ALR+CCl4和ALR+3-MA+CCl4干预组转染ALR质粒,对除正常对照组外其余四组给予CCl4处理,30min后对3-MA+CCl4和ALR+3-MA+CCl4干预组给予3-MA处理,CCl4处理24h后收集细胞。收集HL-7702细胞和培养上清液,检测丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)水平;Westernblot检测细胞中ALR、细胞周期蛋白D、细胞周期蛋白E、增殖细胞核抗原(PCNA)、自噬相关基因7(Atg7)和自噬基因LC3、p62、Beclin-1水平;实时定量PCR检测ALRmRNA水平。多组样本均数的两两比较采用One-wayANOVA分析。结果ALR+CCl4干预组与急性肝损伤组相比,ALR蛋白以及mRNA表达水平显著升高(P值均〈0.05);CCl4急性肝损伤组与正常对照组相比,ALR蛋白以及mRNA表达水平同样显著升高(P值均〈0.05)。ALR+CCl4干预组与CCl4急性肝损伤组相比,细胞上清液中ALT(0.73±0.17与1.43±0.38,P值均〈0.05)、AST(19.85±1.83与56.73±6.25,P值均〈0.05)水平显著降低(单位均为IU/L);肝细胞中再生相关细胞周期蛋白D、细胞周期蛋白E、PCNA表达水平以及自噬相关LC3、Atg7、Beclin-1表达水平显著增高,P62表达水平显著降低,提示ALR可以保护急性肝损伤,促进肝细胞的再生,增强肝细胞的自噬水平。ALR+3-MA+CCl4干预组再生相关蛋白的表达水平相较于ALR+CCl4干预组明显降低,与3-MA+CCl4干预组相比无明显差异,提示抑制自噬后,肝细胞再生水平明显下降,ALR促进肝再生的作用也明显减弱。结论ALR可以促进肝脏实质细胞再生,这种再生是通过调节自噬完成的。 韩伟佳 时红波 时红林 宋金玥 任锋 段钟平 陈煜关键词:肝再生 肝再生增强因子 自噬 糖原合成酶激酶3活性抑制通过激活PPARα对急性肝衰竭小鼠发挥保护性作用 2017年 目的用D-氨基半乳糖/脂多糖(D-GaIN/LPS)诱导的小鼠急性肝衰竭模型,探讨糖原合成酶激酶3(GSK3)D和过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)α信号通路在急性肝衰竭中的作用及其机制。方法以C57BL/6小鼠为研究对象,腹腔注射D-Ga1N/LPS建立小鼠急性肝衰竭模型。用SB216763抑制GSK3p活性,用PPAR仅siRNA抑制PPARα表达。Westernblot检测小鼠中PPARα蛋白表达情况。观察小鼠肝组织病理变化情况以评价肝脏损伤情况,检测血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)评价肝脏功能。实时荧光定量PCR检测肝组织中肿瘤坏死因子(TNF)α、白细胞介素(IL)-1β、IL-12p40mRNA和PPARα基因表达水平。多组样本均数的比较采用单因素方差分析,方差齐者用LSD检验,方差不齐者用Games-Howell法。结果在D-GalN/LPS诱导的肝衰竭小鼠中,抑制GSK3p活性促进了PPARα的mRNA(0.29±0.05与0.17±0.02,F=13.18,P〈0.01)和蛋白(0.79±0.05与0.15±0.04,F=301.36,P〈0.01)表达水平。在D—Ga1N/LPS诱导的急性肝衰竭小鼠中,抑制GSK3β活性减轻了小鼠肝脏出血、炎症和坏死,降低了血清肝功能指标ALT(572.0±127.8与1627.0±412.4,F=25.16,P〈0.01)、AST(479.2±229.2与1359.0±534.8,F=12.96,P〈0.01)水平,也降低了肝组织中炎症因子TNFα(F=32.17,P〈0.01)、IL-1β(F=11.57,P〈0.01)、IL-12β40(F=14.17,P〈0.01)mRNA表达水平。抑制PPARα表达逆转了GSK3p活性抑制带来的肝保护性作用,表现在肝脏出血、炎症和坏死加重,血清肝功能指标AIT(1433.0±464.0与708.7±196.2,F=25.16,P〈0.01)、AST(1361.0±583.2与352.7±177.4,F=12.96,P〈0.01)水平升高,肝组织中炎症因子TNFα(F=32.17,P〈0.01)、IL-1β(F=11.57,P〈0.01)、IL-12p40(F=14.17,P〈0.01)mRNA表 时红波 时红林 张向颖 陈德喜 段钟平 任锋关键词:脂多糖类 糖原合成酶激酶3 过氧化物酶体增殖物激活受体Α D-氨基半乳糖 细胞自噬在D-氨基半乳糖/脂多糖诱导的小鼠急性肝损伤模型中的保护作用及机制 被引量:14 2017年 目的利用D-氨基半乳糖(D-Gal N)/脂多糖(LPS)诱导的小鼠急性肝损伤模型研究细胞自噬在急性肝损伤中的作用及机制。方法以C57BL/6小鼠为研究对象,腹腔注射D-Gal N/LPS建立小鼠急性肝损伤模型。动物实验分组:对照组、DGal N/LPS组、雷帕霉素+D-Gal N/LPS组、三甲基腺嘌呤(3-MA)+D-Gal N/LPS组、Atg7 siRNA+D-Gal N/LPS组。观察不同分组中小鼠的生存情况,观察肝组织病理变化评价肝损伤情况,全自动生化分析仪检测血清ALT、AST水平,实时荧光定量PCR检测肝组织中TNFα和IL-6基因表达,荧光显微镜观察肝组织中肝细胞凋亡情况。多样本组间比较采用One-way ANOVA分析,进一步两两比较,方差齐时采用LSD-t检验,方差不齐时采用Games-Howell法。结果与D-Gal N/LPS组相比,应用自噬激活剂雷帕霉素干预后,小鼠生存率明显升高(80%vs 40%),肝脏出血、炎症和坏死明显减轻,肝细胞凋亡明显减少,血清ALT、AST水平明显降低[ALT:(427.4±195.5)U/L vs(977.7±247.3)U/L,P=0.002;AST:(378.2±169.7)U/L vs(1100.0±438.0)U/L,P=0.004],肝组织中炎症因子TNFα和IL-6 mRNA表达水平明显降低[TNFαmRNA:0.288±0.010 vs 1.136±0.267,P=0.003;IL-6mRNA:0.272±0.061 vs 0.869±0.317,P=0.010];应用自噬抑制剂3-MA和Atg7 siRNA干预后,小鼠生存率明显降低(0、10%vs 40%),肝脏出血、炎症和坏死明显加重,肝细胞凋亡明显增多,血清ALT、AST水平明显升高[ALT:(1836.0±560.5)、(1654.0±627.6)U/L vs(977.7±247.3)U/L,P值分别为0.006、0.034;AST:(1948.0±645.5)、(1804.0±492.6)U/L vs(1100.0±438.0)U/L,P值分别为0.029、0.033],肝组织中TNFα表达水平明显升高[2.026±0.342、1.994±0.286 vs 1.136±0.267,P值分别为0.006、0.005]。结论在D-Gal N/LPS诱导的小鼠急性肝损伤中,细胞自噬发挥着重要的保护性作用,其调控机制可能与自噬抑制炎症因子和肝细胞凋亡有关。 时红波 时红林 张向颖 陈德喜 段钟平 任锋关键词:脂多糖类 TNF-α/ActD协同内质网应激通过调控糖原合成酶激酶3β促进肝细胞凋亡 被引量:1 2017年 目的研究肿瘤坏死因子(tumor necrosis factorα,TNF-α)和放线菌素D(Actinomycin D,ActD)与内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)诱导肝细胞凋亡的相互作用及分子机制。方法分离小鼠原代肝细胞,应用TNF-α和ActD联合诱导的肝细胞凋亡,分别给予ERS激活剂(Tunicamycin,TM)和抑制剂(4-phenylbutyrate,4-PBA),检测细胞上清中分泌的乳酸脱氢酶(LDH)和细胞中caspase-3的表达;在TNF-α/ActD诱导凋亡的基础上,加入4-PBA抑制ERS,检测ERS相关蛋白和糖原合成酶激酶3β(Glycogen synthase kinase 3β,GSK3β)的表达情况。最后在TNF-α/ActD诱导凋亡和TM激活ERS的基础上,加入GSK3β抑制剂(SB216763),检测原代肝细胞凋亡情况。结果 TNF-α/ActD可以明显诱导肝细胞分泌LDH,加入TM后,肝细胞分泌LDH和表达的caspase-3明显增多,而加入4-PBA后,肝细胞分泌LDH和表达的caspase-3明显减少。TNF-α/ActD明显促进了Grp78和CHOP的表达,促进ERS的活化;ERS抑制增强GSK3β磷酸化水平,降低GSK3β活性,但TNF-α/ActD对GSK3β活性无明显影响;TNF-α/ActD可以直接诱导肝细胞发生凋亡,加入TM后,凋亡的细胞明显增多,但是加入GSK3β抑制剂后,细胞凋亡明显减少。结论TNF-α/ActD协同ERS诱导了肝细胞的凋亡,其分子机制可能与GSK3β的活化有关。 时红波 时红林 张向颖 陈德喜 段钟平 任锋关键词:内质网应激 肿瘤坏死因子 放线菌素D 糖原合成酶激酶3Β 肝再生增强因子通过增加调节T细胞数量保护小鼠急性肝损伤 被引量:3 2015年 目的研究肝再生增强因子(ALR)保护急性肝损伤的作用及机制。方法将30只BALB/c小鼠随机分为正常对照组、急性肝损伤组和ALR干预组。急性肝损伤组小鼠按2 m L/kg体质量的剂量予以腹腔注射500 m L/L四氯化碳(CCl4)矿物油溶液1次。ALR干预组于CCl4注射前8 h尾静脉注射ALR质粒,正常对照组注射等量生理盐水注射液。收集小鼠肝组织和血液标本,HE染色观察肝组织病理形态学变化;生化法检测血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)水平;流式细胞术检测肝组织中调节性T细胞(Treg)的数量,实时定量PCR(qRT-PCR)检测肝组织Foxp3、ALR、白细胞介素6(IL-6)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)的mRNA水平。结果 ALR干预组小鼠肝组织中ALR mRNA表达水平显著高于急性肝损伤组和正常对照组,急性肝损伤组与正常对照组相比无明显差异;流式细胞术检测结果显示ALR干预组小鼠肝组织中CD25+Foxp3+Treg/CD4+T细胞为(5.90±0.10)%,高于急性肝损伤组的(4.23±0.46)%和正常对照组的(2.93±0.74)%,急性肝损伤组显著高于正常对照组;ALR干预组小鼠肝组织中Foxp3 mRNA表达水平高于急性肝损伤组和正常对照组,急性肝损伤组高于正常对照组,但差异无统计学意义;ALR干预组与急性肝损伤组相比,IL-6 mRNA、TNF-αmRNA表达水平降低,而与正常对照组相比无明显变化,急性肝损伤组与正常对照组相比,IL-6 mRNA、TNF-αmRNA表达水平明显升高。结论 ALR通过上调Treg数量保护小鼠急性肝损伤,可能与Treg下调肝脏IL-6、TNF-α表达有关。 孙海青 娄金丽 刘新 时红波 任锋 段钟平关键词:急性肝损伤 调节性T细胞 Protective Effect of Ganshuang Granules(肝爽颗粒)on Liver Cirrhosis by Suppressing Regulatory T Cells in Mouse Model 被引量:12 2019年 Objective: To investigate the potential antifibrotic mechanisms of Chinese medicine Ganshuang Granules(肝爽颗粒, GSG) and to provide clinical therapeutic evidence of its effects. Methods: A cirrhotic mouse model was established by intraperitoneally injecting a mixture of CCl_4(40%) and oil(60%) at 0.2 mL per 100 g of body weight twice a week for 12 weeks. After 12-week modeling, GSG was intragastric administrated to the mice for 2 weeks, and the mice were divided into low-, medium-and high-dose groups at doses of 1, 2 and 4 g/(kg·day), respectively. Liver morphology changes were observed using Masson's trichrome staining and B-ultrasound. The levels of alanine aminotransferase(ALT), aspartate aminotransferase(AST) and hyaluronic acid(HA) in serum were detected using an automatic biochemistry analyzer. The expressions of desmin, smooth muscle actin(SMA) and Foxp3 in liver were detected by immunofluorescence. The regulatory T cell(Treg) frequency was determined through flow cytometry analysis. Collagen-Ⅰ, SMA, IL-6, tumor necrosis factor α(TNF-α), interleukin(IL)-1β and transforming growth factor β1(TGF-β1) expression levels were measured using quantitative polymerase chain reaction(qPCR). Results: Masson's staining result showed fewer pseudolobule structures and fibrous connective tissue in the GSG-treatment groups than in the spontaneous recovery group. Ultrasonography showed that GSG treatment reduced the number of punctate hyperechoic lesions in mice cirrhotic livers. The serum ALT, AST, HA levels were significantly ameliorated by GSG treatment(ALT: F=8.104, P=0.000; AST: F=7.078, P=0.002; and HA: F=7.621, P=0.001). The expression levels of collagen-Ⅰ and SMA in the cirrhotic livers were also attenuated by GSG treatment(collagen-Ⅰ: F=3.938, P=0.011; SMA: F=4.115, P=0.009). Tregs, which were elevated in the fibrotic livers, were suppressed by GSG treatment(F=8.268, P=0.001). The expressions of IL-6, TNF-α and IL-1β increased, and TGF-β levels decreased in the cirrhotic livers after GSG treatme LIU Yan-min SHI Hong-bo LIU Yi-rong SHI Hong-lin REN Feng CHEN Yu CHEN De-xi LOU Jin-li DUAN Zhong-ping关键词:GRANULES CIRRHOSIS CELL CELL 感染性疾病诊断新技术实验课的教学实施与探讨 2014年 加强学生对感染性疾病诊断新技术的认识,可以为其未来的临床和科研工作奠定好基础。学生通过对实时荧光定量PCR技术检测病毒核酸定量、分子克隆方法检测病毒变异耐药位点的实验操作和理论学习,掌握了病毒核酸定量和病毒变异耐药位点检测的基本方法和基本理论。通过开设这门实验课,学生能够理论联系实际,学生对感染性疾病的诊断技术有了全面的认识,并能将所学知识应用于临床和科研实际工作中,达到了开设该门课程的效果。 时红波 胡耀芬 时红林 任锋 王彦军 陈德喜关键词:感染性疾病 教学实施 实验课 自噬与肝再生关系的研究进展 被引量:1 2016年 自噬是细胞内的一种降解途径,通过形成自噬泡将细胞内生物大分子和受损细胞器运送至溶酶体进行降解,在维持肝脏功能的动态平衡中发挥着重要作用,肝脏通过自噬可消除异常肝细胞。回顾了自噬和肝细胞、非实质肝细胞以及肝干细胞增殖的密切关系,分析表明自噬可通过促进肝细胞、肝干细胞的增殖从而恢复肝脏的体积和功能,并能够适时终止,防止肿瘤的发生;而功能失调时,自噬可能通过增强非实质肝细胞的活化,进而抑制肝细胞再生,同时导致纤维化的发生和发展;肿瘤形成阶段,自噬在正常细胞向癌细胞转化的过程中发挥重要作用,肝细胞恶性再生被激活但不能适时终止。 韩伟佳 时红波 陈煜关键词:肝再生 自噬 肝再生增强因子在肝脏中的作用 2013年 肝再生增强因子(ALR)除了促进肝再生,保护肝损伤之外,可能在肝脏的器官形成和发育中也发挥着重要作用。介绍了ALR在肝脏中的生物学功能和机制研究的最新进展,并归纳总结了ALR在肝脏疾病的诊断和治疗中的应用。指出ALR可能通过线粒体途径调控肝细胞的凋亡,从而参与肝脏的修复和再生。未来ALR可能作为肝衰竭患者肝再生及预后评估的候选分子,并有望成为临床治疗严重肝病和肝衰竭的有效药物。 时红波 段钟平关键词:肝再生增强因子 肝再生 肝疾病 肝爽颗粒对CCl_4诱导的慢性肝损伤小鼠模型和肝损伤细胞模型的保护作用 被引量:21 2015年 目的本研究拟初步探讨肝爽颗粒通过细胞自噬在保护四氯化碳(CCl4)诱导小鼠慢性肝损伤模型和肝损伤细胞模型中的作用和机制,为其临床应用提供依据。方法 CCl4腹腔注射构建小鼠慢性肝损伤模型,CCl4体外诱导肝细胞系7702细胞构建肝损伤细胞模型。建模成功后给予肝爽颗粒进行干预,同时设立正常对照组和未给予肝爽颗粒的CCl4组。在此基础上,应用自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)抑制细胞自噬并观察肝爽颗粒对细胞凋亡的影响。HE染色观察肝组织损伤情况;生化法测定血清ALT、AST水平;免疫荧光染色法、Western Blot观察细胞自噬情况;流式细胞术及Annexin V/PI双标记免疫荧光染色法检测肝细胞凋亡情况。多组间比较采用方差分析,方差齐采用LSD检验,方差不齐采用Dunnett T3检验。结果 HE染色显示肝爽颗粒干预组小鼠肝组织损伤程度较CCl4组明显减轻,3组间ALT和AST总体表达水平差异有统计学意义(F值分别为15.76、13.35,P值均<0.05);体内细胞实验和体外动物实验免疫荧光结果均显示肝爽颗粒干预组细胞自噬表达较CCl4组明显增加,肝细胞凋亡较CCl4组明显减少。加入3-MA后肝爽颗粒的保护性作用减弱,细胞凋亡增加。流式细胞仪检测结果显示5组7702细胞凋亡比例差异有统计学意义(F=25.637,P<0.01)。结论肝爽颗粒对肝脏损伤具有保护性作用,其抗凋亡机制可能与肝爽颗粒增强细胞自噬有关。 孙海青 王小琪 时红波 娄金丽 陈煜 段钟平关键词:肝爽颗粒