国家科技支撑计划(2012BAD25B02)
- 作品数：57 被引量：269H指数：10
- 相关作者：吴淑勤石存斌李宁求林强付小哲更多>>
- 相关机构：中国水产科学研究院珠江水产研究所中国水产科学研究院黑龙江水产研究所上海海洋大学更多>>
- 发文基金：国家科技支撑计划国家现代农业产业技术体系建设项目国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：农业科学生物学经济管理更多>>
- 鳜传染性脾肾坏死病毒ORF093基因的克隆、表达及其重组蛋白的免疫原性分析被引量：3
- 2013年
- 从患传染性脾肾坏死病毒(infectious spleen and kidney necrosis virus,ISKNV)病的鳜体内获得ORF093基因。采用PCR方法扩增ISKNV ORF093基因全长,克隆入原核表达载体pET32a(+),IPTG诱导表达,Ni柱纯化后,免疫新西兰大白兔制备兔抗重组093蛋白血清,免疫印记分析兔抗血清的特异性,中和实验和免疫保护实验分析重组093蛋白的免疫原性。结果显示:ISKNV重组093蛋白可以在大肠杆菌中以包涵体形式存在;制备的兔抗血清可以特异性识别重组093蛋白,对ISKNV具有中和作用,可给鱼体提供至少10 d的100%预防保护;重组093蛋白对ISKNV的攻击具有保护作用,攻毒后15 d,093免疫组平均相对保护率为45.3%。结果说明重组093蛋白具有一定的免疫原性,可作为ISKNV候选疫苗抗原和治疗血清制备抗原。本研究通过中和实验及免疫保护实验对重组093蛋白的免疫原性进行分析,旨在为鳜ISKNV重组亚单位疫苗的研制奠定基础。
- 付小哲李宁求彭媛媛林强石存斌黄志斌吴淑勤
- 关键词：免疫原性
- 鱼致病性舒伯特气单胞菌双重PCR检测方法的建立被引量：8
- 2014年
- 为快速准确鉴别检测鳢源致病性舒伯特气单胞菌(A.schubertii),本实验根据该菌的促旋酶B亚单位基因(gyrB)、溶血素基因(hlyA)的保守序列设计引物,建立了检测致病性A.schubertii的双重PCR方法。结果显示gyrB和hlyA基因扩增产物分别为601 bp和375 bp;其最低检出菌体DNA量为2.3×10-2ng,最低检出菌数为3×102cfu。特异性试验结果显示,该方法对温和气单胞菌、嗜水气单胞菌、无乳链球菌、诺卡氏菌、迟缓爱德华氏菌、荧光假单胞菌、柱状黄杆菌、哈氏弧菌以及类志贺邻单胞菌扩增结果均为阴性。应用该方法对37份临床病料样品的检测结果与传统细菌分离鉴定结果的符合率为100%,表明该方法具有良好的特异性和敏感性,可以应用于A.schubertii的快速检测和流行病学研究。
- 刘春李凯彬王庆王芳曾伟伟石存斌吴淑勤
- 关键词：双重PCR
- 五条鰤源美人鱼发光杆菌杀鱼亚种的分离鉴定及药物敏感试验被引量：4
- 2012年
- 2007年5月广东汕尾红海湾网箱养殖的五条鰤爆发主要症状为脾脏、肾脏出现许多灰白色小结节的疾病。从病鱼体内分离出1株优势菌株,命名为SWZX5,为革兰氏阴性杆菌。SWZX5对剑尾鱼有强致病性,其半数致死量为5.8×105CFU/g。综合细菌在形态、生理生化特性及16S rRNA系统发育树等方面的研究结果,确认分离菌株SWZX5属于美人鱼发光杆菌杀鱼亚种(Photobacterium damselae subsp.piscicida)。15种中草药提取液的抑菌和杀菌试验显示,五倍子的功效最好,MIC和MBC均为0.05mg/mL;其次是黄连、石榴皮,两者MIC均为0.20 mg/mL,MBC均为0.40 mg/mL;黄芪功效较差。20种化学抗菌类药物的抑菌试验显示,分离菌株SWZX5对供试的氨曲南、恩诺沙星、左旋氧氟沙星、头孢呋辛钠等16种抗菌药物敏感;对卡那霉素、苯唑西林等4种抗菌药物中度敏感或耐药。
- 任燕石存斌常藕琴付小哲陶家发吴淑勤
- 关键词：中草药
- 草鱼免疫防控技术概述
- 2017年
- 草鱼是我国的四大家鱼养殖品种之一,从南方到北方都是主养品种,全国草鱼年产量近500万吨,占淡水养殖总产量的20%以上。但草鱼发病严重,从苗种到成鱼成活率仅30%左右,为了提高成活率,我国南方部分省市如广东省在鱼种放养时普遍注射疫苗,成活率达80%以上。
- 赵长臣刘春花江小燕陈总会黄志斌
- 关键词：草鱼出血病防控技术鱼种放养四大家鱼晶体敌百虫
- 鱼类miRNAs及其在抗病毒天然免疫中的作用研究进展
- 2016年
- MicroRNA（miRNA）是一类由内源基因编码的长度约为22个核苷酸的非编码单链RNA，它们在动植物中参与转录后基因表达调控。在机体抗病毒天然免疫反应中，miRNAs不仅可直接调节病毒的复制，更能够对机体的抗病毒天然免疫发挥多方面的调控作用，
- 曹永生张奇亚卢彤岩
- 关键词：MIRNAS天然免疫鱼类基因表达调控基因编码免疫反应
- 抗传染性胰腺坏死病毒VP3蛋白单克隆抗体的制备被引量：2
- 2013年
- 利用纯化后的传染性胰腺坏死病毒(IPNV VP3)重组蛋白免疫BALB/c小鼠,通过细胞融合技术,采用间接ELISA和有限稀释法筛选杂交瘤细胞,利用染色体鉴定、蛋白印迹和免疫荧光等方法对单克隆抗体进行鉴定,共得到2株能稳定分泌特异性抗体的阳性细胞株,分别命名为2F1、4A7,亚类鉴定2株单抗均为IgG1亚类。ELISA检测其腹水效价,蛋白印迹检测表明获得的2株单抗均能特异性识别IPNV VP3蛋白;间接免疫荧光鉴定表明2株单抗均与IPNV发生反应;间接ELISA检测结果表明2株单抗均不与HSV、SVCV、HRV等病毒反应,与IPNV具有较强的特异性反应。
- 刘立月刘巍巍赵丽丽葛俊伟唐立杰刘敏李一经
- 关键词：VP3蛋白单克隆抗体
- 传染性胰腺坏死病毒VP2 COE蛋白单克隆抗体的制备与初步应用被引量：9
- 2013年
- 为制备抗IPNV VP2蛋白的单克隆抗体,对其基本特性进行鉴定并进行初步应用。实验利用Ni-NTA亲和层析纯化的IPNV VP2 COE重组蛋白作为免疫原,免疫8周龄的雌性BALB/c小鼠,经3次免疫后,将免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤SP2/0细胞融合。采用间接ELISA和有限稀释法筛选杂交瘤细胞,共得到2株能稳定分泌特异性抗体的阳性细胞株,分别命名为5G10和5F3,亚类鉴定均为IgG1亚类。2株杂交瘤细胞的染色体数目在75～120之间。间接ELISA检测5G10和5F3细胞培养上清的效价分别为1∶105、1∶102,腹水效价分别为1∶108、1∶104。Western-blotting和间接免疫荧光鉴定结果显示,2株单抗均能特异性地识别IPNV。间接ELISA表明,2株单抗不与IHNV、VHSV、SVCV、HRV等病毒反应,说明获得的单抗具有高度的特异性。相加ELISA实验结果显示,2株单克隆抗体分别识别IPNV VP2蛋白上不同的抗原位点。应用间接免疫荧光方法对临床确定为患有IPN虹鳟肝组织进行检测,结果证实该2株单克隆抗体可用于后续实验。
- 连科迅赵丽丽张琳琳贾鹏唐立杰葛俊伟李一经刘敏
- 关键词：单克隆抗体
- 重组虹鳟IFN-γ2的原核表达及抗IHNV活性分析被引量：4
- 2016年
- 为获得虹鳟IFN-γ2(rt IFN-γ2)抗传染性造血器官坏死病毒(IHNV)活性的相关数据,实验根据NCBI已发表序列设计引物,提取经植物血凝素刺激后的虹鳟头肾细胞总RNA,采用RT-PCR方法扩增471 bp的该基因完整开放阅读框。将该基因重组至原核表达载体p ET32a中,并转化大肠杆菌Rosetta,进行诱导表达,SDS-PAGE结果显示,目的蛋白以包涵体形式表达,大小约为38.4 ku。重组蛋白经复性、纯化后在CHSE-214细胞上进行抗IHNV活性分析,结果显示,rt IFN-γ2在CHSE-214细胞上抗IHNV活性为6.63×106U/mg。Real-time PCR结果显示,rt IFN-γ2免疫后,虹鳟头肾、脾、肝中IRF-1、IRF-2、IFN-I、IFN-γ和Mx表达水平均显著提高,总体而言免疫后2天机体抗病毒状态弱于免疫后1天。攻毒保护实验结果显示,免疫后1天进行IHNV攻击时,鱼死亡率为40%,而免疫后2天进行IHNV攻击时,鱼死亡率达到80%。研究表明,原核表达系统制备的重组虹鳟IFN-γ2不仅具有体外抗IHNV活性,更能激发虹鳟的抗病毒状态,从而为虹鳟抵抗IHNV感染提供一定的保护力。
- 曹永生徐黎明赵景壮刘淼张奇亚卢彤岩
- 关键词：原核表达
- 草鱼呼肠孤病毒HZ08株S10编码蛋白多克隆抗体制备及其特性分析被引量：2
- 2014年
- 为研究草鱼呼肠孤病毒(GCRV)HZ08株S10基因节段编码蛋白的可能功能,采用PCR方法扩增草鱼呼肠孤病毒HZ08株S10基因节段,并把该基因节段克隆至表达载体pET-32a(+),获得的重组表达载体pET-32a-S10转化到大肠杆菌BL21(DE3)菌株,用IPTG诱导表达,表达产物通过SDS-PAGE分析鉴定后,再通过变性、过Ni柱纯化、透析复性纯化获得目的蛋白。然后用纯化的重组蛋白免疫昆明小白鼠,制得多克隆抗体,用间接ELISA方法测定抗体效价,用Western blot和IFA(间接免疫荧光试验)鉴定抗体特异性。结果表明,SDS-PAGE分析表达的重组蛋白约为53 ku,大小与预期相符,目的蛋白主要存在于包涵体中;过Ni柱纯化、透析复性纯化后的重组蛋白纯度可达97.4%;间接ELISA测得制备的多克隆抗体效价约为1∶106,Western blot和IFA结果显示,制备的多克隆抗体能识别HZ08毒株,表明S10编码蛋白为GCRV-HZ08株的结构蛋白。
- 李永刚曾伟伟王庆殷亮王英英梁红茹刘春石存斌吴淑勤
- 关键词：草鱼呼肠孤病毒多克隆抗体
- 鱼源嗜水气单胞菌疫苗生产菌株与分离株的抗原性分析被引量：2
- 2015年
- 为分析商品化嗜水气单胞菌（Ah）败血症灭活疫苗生产菌株J-1与近年来分离的YYK090901菌株的抗原性是否存在差异,本研究应用western blot检测了抗J-1血清和抗YYK090901血清识别28株嗜水气单胞菌全菌蛋白情况,并通过细菌凝集试验测定了这2种抗血清与28株菌株的凝集效价。结果表明2种抗血清均能够识别25株菌株的大多数全菌蛋白,但识别GYK1、G060718-2L、Ah120606L 3株菌株的蛋白条带较少,2种抗血清识别同一株菌的全菌蛋白条带不完全一致。抗YYK090901血清对YYK090901、Ah120606L、JX120701具有较高的凝集价（211）,对J-1、GYK1等16株菌的凝集价为26~210,其中对J-1、GYK1的凝集价分别为27、210;对N-1-2、TTF20130613L等9株菌的凝集价较低,为24~25。抗J-1血清对1990s年和2012年~2013年分离的大部分菌株均具有较高的凝集价（211~212）,仅对GYK1、TTF20130613L等6菌株凝集价较低,为24~25。本研究结果表明,J-1与YYK090901的抗原性存在一定的差异。
- 任燕张德峰孙承文陶家发李宁求刘礼辉石存斌吴淑勤
- 关键词：嗜水气单胞菌抗原性
