广东省农业科技攻关项目(20052490100)
- 作品数：10 被引量：55H指数：4
- 相关作者：宋长绪张福良刘燕玲郝永清杨增岐更多>>
- 相关机构：广东省农业科学院西北农林科技大学内蒙古农业大学更多>>
- 发文基金：广东省农业科技攻关项目广东省自然科学基金国家高技术研究发展计划更多>>
- 相关领域：农业科学生物学更多>>
- 荧光定量RT-PCR检测猪日本脑炎病毒被引量：6
- 2007年
- 通过RT-PCR方法克隆了日本脑炎病毒(JEV)N基因片段序列,构建重组质粒作为标准阳性模板,同时根据GenBank中的靶序列设计了荧光定量RT-PCR的1对引物和1条TaqMan探针。通过条件优化,以定量的10倍系列稀释的质粒为标准品进行荧光定量PCR扩增并制作标准曲线,建立了JEV检测的荧光定量PCR方法。结果表明,该方法检测灵敏度可达1.0×100拷贝/μL,线性范围为109～100,达10个数量级;对起始浓度为1.0×109、1.0×108和1.0×107拷贝/μL的标准品的最终实际测得值(Ct)分别为17.33、20.52和23.90,变异系数分别为0.54%、0.74%和0.53%,均小于5%。对阳性组织病料的检测表明该方法的灵敏度高出常规PCR,与套式PCR(nested-PCR,nPCR)具有相近的灵敏度。
- 孙彦伟刘建营徐维加田云王晶钰宋长绪
- 关键词：日本脑炎病毒荧光定量PCRTAQMAN探针
- 猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株的致病性试验被引量：3
- 2009年
- 【目的】研究从江西、湖南发生持续高热的病猪体内分离的4株NSP2基因缺失的猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）Jiangxi-3、Jiangxi-4、Hunan-1、Hunan-2的致病力。【方法】通过Reed—Muench法，测定4株PRRSV（第3代）的TCID50，将毒株分别接种PRRSV和猪圆环病毒2型（PCV2）抗原与抗体均为阴性的健康猪，各设同居试验猪，通过检测体温、临床症状观察、RT—PCR、ELISA、病理切片等方法检测病毒的致病性。【结果】4株病毒的TCID50为10^-3.75～10^-4.5／mL。攻毒试验猪和同居试验猪均表现典型猪繁殖与呼吸综合征临床症状，最后试验猪均死亡。病理切片也显示典型的猪繁殖与呼吸综合征病理变化，并在脑组织内检测到PRRSV核酸。【结论】4株PRRSV分离株的致病力增强。
- 王旭荣张彩勤张春红赵炳武祝卫国杨增岐王建华宋长绪
- 关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株猪高热病
- 两株不同来源的猪圆环病毒1型ORF2基因的克隆与序列分析被引量：1
- 2006年
- 根据GenBank中猪圆环病毒1型（PCV1）ORF2基因序列，设计了1对引物，应用PCR方法从PK-15细胞和疑似患断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）的仔猪组织病料中分别扩增出了PCV1 ORF2全基因（702bp）。将此基因片段克隆入pMD18-T载体，筛选获得了重组质粒pMD-PCV1-ORF2，并对其进行了测序与分析。结果表明：所克隆的PK-15来源和组织病料来源的ORF2基因的同源性为99．4％，二者与GenBank中登录的PCV1 ORF2基因的同源性为97．3％～99．9％，与PCV2 ORF2基因的同源性为67．9％～68．4％，二者编码的蛋白在几个功能区比较保守。抗原表位预测表明，PCV1 ORF2编码的蛋白具有良好的免疫原性。
- 张福良孙丽华宋长绪杨鸣琦郝永清刘燕玲武占银
- 关键词：猪圆环病毒1型ORF2基因克隆
- 猪圆环病毒2型荧光定量PCR检测方法的建立被引量：18
- 2006年
- 通过条件优化，以定量的10倍系列稀释质粒pMD—ORF2（含PCV2-ORF2全基因）为标准品，进行荧光定量PCR扩增并制作标准曲线，建立了猪圆环病毒2型（PCV2）的荧光定量PCR检测方法。该方法检测灵敏度可达1．0×10^6拷贝／μL，线性范围为10^9～10^0，达10个数量级；对起始浓度为1．0×10^6、1．0×10^5、1．0×10^4拷贝／μL的标准品的最终实际测得值分别为1．000×10^6、0．935×10^5、0．987×10^4拷贝／μL，变异系数分别为2．527％、2．067％、2．092％。该方法的检测灵敏度与套式PCR（nPCR）相当，甚而高于常规PCR。
- 张福良宋长绪杨鸣琦朱道中蒋智勇林志雄刘燕玲宋志军
- 关键词：猪圆环病毒2型荧光定量PCRTAQMAN探针
- PRRSV流行株Nsp2、ORF5和ORF3基因序列的分析被引量：2
- 2008年
- 采用RT-PCR方法扩增2006年--2007年从江西、湖南、海南、广东等4省的不同猪场病猪体内分离的11株猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）流行株的Nsp2、ORF5和ORF3基因，并进行序列分析。结果表明，11个PRRSV流行株的Nsp2均发生30个氨基酸的不连续缺失，缺失位置与JXA1毒株相同；11个PRRSV流行株的ORF5、ORF3基因和JXA1相应序列的核苷酸同源性分别为99．2％～99．8％、99．1％～99．6％，氨基酸同源性分别为98．0％～99．5％、98．4％～99．6％；11个PRRSV流行株之间ORF5基因的核苷酸同源性和氨基酸同源性分别为98．8％～100．0oA、98．0oA～100．0％，其中5个流行株的ORF3基因的核苷酸和氨基酸同源性分别为99．0％～99．6％、98．8％～99．69，6。根据Nsp2所建立的遗传系统发育树可知这11个PRRSV流行株与JXA1株的亲缘关系很近。
- 王旭荣张彩勤赵炳武张春红杨增岐宋长绪
- 关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP2ORF5ORF3
- 猪繁殖与呼吸综合征病毒RdRp基因的克隆与原核表达被引量：1
- 2009年
- 将猪繁殖与呼吸综合征病毒RNA依赖性的RNA聚合酶(RdRp)基因进行克隆、表达,并获得纯化重组蛋白,为进一步研究猪繁殖与呼吸综合征病毒RdRp的功能奠定基础。以RdRp基因cDNA为模板,用PCR扩增出RdRp基因片段,应用定向克隆策略将扩增后片段与高效表达载体pET32a(+)重组,阳性克隆重组质粒经酶切及测序鉴定,IPTG诱导高效表达。PCR法扩增出720 bp的片段,酶切及测序鉴定获得正确的重组质粒,在大肠埃希菌LB21中表达得到分子质量约为46 ku的融合蛋白。成功克隆及表达了猪繁殖与呼吸综合征病毒RdRp基因。
- 蔡汝健宋长绪郝永清杨鼎何锦玲
- 关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒克隆原核表达
- 猪圆环病毒2型实时荧光定量PCR检测标准阳性模板的构建被引量：8
- 2007年
- 采用PCR方法克隆了猪圆环病毒2型（PCV2）ORF2基因，将构建的重组质粒pMD-ORF2作为PCV2实时荧光定量PCR（FQ-PCR）检测的标准阳性模板，并对该模板进行了酶切及测序鉴定。结果显示，此模板特异性强，稳定性好，一20℃保存20d无显著变化；对起始浓度为1．0×10^6、1．0×10^5、1．0×10^4拷贝／弘L的pMD-ORF2标准品的最终实际测得值分别为1．000×10^4、0．935×10^5和0．987×10^4，其变异系数分别为2．527％、2．067％和2．092％。表明，以此模板进行FQ—PCR具有良好的准确性和重现性。该模板的检测线性范围宽，当稀释度为1．0×10^9～1．0×10^5拷贝／μL时，相关系数r=0．989。
- 张福良靳玉芬郝贵增宋长绪朱道中
- 关键词：猪圆环病毒2型实时荧光定量PCR
- 猪葡萄球菌脱落毒素研究进展被引量：12
- 2009年
- 猪渗出性皮炎是一种由猪葡萄球菌引起的哺乳或断奶仔猪的急性传染病。猪葡萄球菌产生的脱落毒素被认为是引起猪渗出性皮炎的主要因子之一,不同毒株可以产生不同的毒素,分别被命名为Ex-hA、ExhB、ExhC和ExhD 4种。论文就近年来对猪葡萄球菌脱落毒素的结构特征、生物学功能以及在诊断和免疫学方面的研究进行综述。
- 杨鼎郝永清宋长绪
- 关键词：渗出性皮炎猪葡萄球菌
- 广东省猪PCV-2感染的病原学调查被引量：3
- 2008年
- 2004年-2006年从广东省4个不同地区458个规模化猪场采集2128份病料，进行了PCV-2的抗原检测，结果表明，被检地区的猪群中普遍存在PCV-2感染，检测的458个规模化猪场中有372个猪场有PCV-2阳性猪，平均阳性率达到81．22%；2128份被检病料样品中有863份为阳性，平均阳性率达40．55％（863／2128）；不同地区不同时段猪场阳性率为63．64％～92．86％，病料样品的阳性率为24．00%～48．00％。
- 刘燕玲蒋智勇黄忠林志雄宋长绪
- 关键词：猪圆环病毒2型病原学
- 猪圆环病毒2型DNA疫苗对小鼠的免疫效果被引量：4
- 2008年
- 【目的】构建一种猪圆环病毒2型DNA疫苗,并对其免疫效果进行了研究。【方法】将表达猪圆环病毒2型ORF2基因的1套真核表达元件系统克隆插入到质粒载体pMD-18T,构建成pMD-18T-ORF2,转入E.coliDH5α,提取质粒,经肌肉注射途径对Balb/c小鼠分别在第1,14和28天进行免疫,用生理盐水代替pMD-18T-ORF2进行相同操作,作为对照组,通过监测免疫小鼠体液免疫和细胞免疫的状况,评估分析pMD-18T-ORF2免疫的效果。【结果】初次免疫后小鼠血清中特异性抗体水平持续升高,在第14天达到峰值,加强免疫抗体水平无显著变化;试验组脾淋巴细胞体外增值能力较对照组低(P<0.01);免疫pMD-18T-ORF2的小鼠脾脏NK细胞杀伤活性极显著高于对照组(P<0.01);试验组小鼠脾脏中Th细胞含量与对照组小鼠无显著差异(P>0.05),Tc细胞含量显著高于对照组(P<0.05),B细胞含量较对照组有所减小,但差异不显著(P>0.05)。【结论】构建的pMD-18T-ORF2对小鼠能产生相应的免疫反应,且细胞免疫的效果较体液免疫更显著,非特异性免疫亦有提高。
- 王建龙赵路易张洪利丛丽媛刘建营杨增岐宋长绪
- 关键词：猪圆环病毒2型DNA疫苗小鼠免疫效果
