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马铃薯卷叶病毒的RT-LDR-PCR检测: 2011年; 马铃薯卷叶病毒（Potato leaf roll virus,PLRV）属黄症病毒科Luteoviridae黄花病毒属Polerovirus,是目前严重影响马铃薯产量与品质的病毒,其分布局限于寄主植物的韧皮部,且含量非常低,难于提纯,这给PLRV检测带来很大的困难[1]。; 汪平郭瑶程菊会董沁芳商晗武姜永厚; 关键词：马铃薯卷叶病毒 PCR检测马铃薯产量 LEAF 寄主植物 PLRV

猪细小病毒LDR-PCR检测方法的建立和应用: 2012年; 为准确特异灵敏地检测猪细小病毒(PPV),建立一种新的LDR-PCR方法。首先在病毒的保守区内设计一对LDR探针,LDR探针两端各连有一段引物对应序列,以连接产物为模板进行PCR,琼脂糖凝胶电泳检测结果。以标准质粒为模板,通过对LDR反应的退火温度、连接酶浓度及探针浓度等反应条件进行优化,确定了LDR最佳的反应体系,并建立了LDR-PCR方法。结果表明,可以特异地检测PPV,与猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、伪狂犬病毒(PRV)、猪圆环病毒(PCV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)无交叉反应;最低检测限为102个拷贝。利用建立的方法对41例临床样本进行检测,14份样品PPV阳性,与普通PCR检测结果符合率为97.6%。; 董沁芳郭瑶汪平程菊会徐辉丁先锋郭江峰姜永厚; 关键词：猪细小病毒

同时检测猪圆环病毒2型、猪细小病毒和伪狂犬病毒连接酶检测反应-PCR基因芯片检测方法的建立被引量：3: 2011年; 为快速、灵敏、准确地同时检测和鉴别猪圆环病毒2型(PCV2)、猪细小病毒(PPV)和伪狂犬病毒(PRV)的方法,本研究采用连接酶检测反应(LDR)-PCR和基因芯片技术建立一种新型检测方法。首先在3种病毒的保守区内分别设计一对LDR探针,两端各连接一段通用序列,依次进行LDR、通用引物荧光标记扩增和芯片杂交,同时比较引物标记和Cy5-dCTP标记方法的灵敏度。结果表明该方法可以特异地检测PCV2、PPV和PRV3种病毒,而对牛病毒性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒、猪瘟病毒、乙型脑炎病毒、猪圆环病毒1型检测结果均为阴性;对3种病毒的最低检测限少于10个拷贝;Cy5-dCTP标记检测的灵敏度显著高于引物标记。利用建立的方法对41例临床样品进行检测,与普通PCR检测结果符合率为97.6%～100%。该方法的建立为基础研究和临床应用提供了技术平台。; 郭瑶汪平董沁芳程菊会徐辉丁先锋郭江峰姜永厚; 关键词：通用芯片猪病毒

猪圆环病毒2型ORF4基因的原核表达及多克隆抗体的制备被引量：5: 2014年; 猪圆环病毒2型（PCV2）是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）的主要病原，ORF4是PCV2中继ORF1，ORF2，ORF3之后的第四大开放阅读框。本研究以提取的PCV2基因组为模板经PCR扩增获得ORF4基因（386～565 nt），并克隆到pGEX-4T-1表达载体上，构建pGEX -4T-ORF4表达载体。经PCR和测序鉴定后，将重组质粒转化受体菌BL21诱导表达并进行目的蛋白GST-ORF4纯化，然后用纯化的蛋白免疫新西兰兔，在免疫期间采血并用间接ELISA对多抗血清进行效价测定。 SDS-PAGE电泳检测结果表明，重组质粒成功表达了目的蛋白。 ELISA检测结果显示抗体效价达到1∶12800以上。 Western blot分析表明ORF4融合蛋白具有很好的免疫原性，获得的抗体可以和大肠杆菌表达的GST-ORF4融合蛋白特异性反应。; 王净修高章照姜永厚吴海港饶品彬全滟平徐辉; 关键词：猪圆环病毒2型原核表达多克隆抗体

基于多重PCR的寡核苷酸基因芯片检测猪瘟病毒,猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒及猪圆环病毒1型和2型被引量：7: 2010年; 为了建立一种可同时检测区分猪瘟病毒(CSFV),猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)和猪圆环病毒2型(PCV-2)的寡核苷酸基因芯片方法,本研究针对每种病毒设计了4条～6条寡核苷酸探针,检测低限为1.6×104PCV-2拷贝数/μL,1.6×104CSFV拷贝数/μL,1.6×105PRRSV拷贝数/μL,比琼脂糖凝胶灵敏约10倍。利用建立的寡核苷酸基因芯片方法对76个仔猪样本进行了检测,检出了3种病毒的存在,其中25个样本(32.9%)同时感染了2种以上病毒。结果表明寡核苷酸基因芯片检测是一种快速、灵敏和高效的猪只混合感染病毒的病原学诊断方法。; 姜永厚商晗武徐辉朱良俊丁先锋陈伟杰赵灵燕方立; 关键词：基因芯片猪瘟病毒猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒猪圆环病毒

快速实时荧光定量PCR检测猪繁殖与呼吸综合症病毒方法的建立被引量：5: 2015年; 为建立一种快速准确检测猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)的基于TaqMan实时荧光定量PCR方法,根据猪繁殖与呼吸综合症病毒的ORF7保守序列分别设计引物和TaqMan探针,在常规PCR的基础上,设计并优化基于TaqMan探针的荧光定量PCR检测PRRSV的方法。结果表明本研究建立的基于TaqMan探针的实时荧光定量PCR体系相关系数大于99%,扩增效率为97%,具有良好的线性关系。利用建立的方法检测猪圆环病毒2型(PCV2)、猪细小病毒(PPV)、伪狂犬病毒(PRV)、猪瘟病毒(CSFV)、日本脑炎病毒(JEV),结果均为阴性,说明此方法具有较好的特异性。灵敏度试验表明该方法检测极限为5copies/μL;应用建立的方法对58份血清样本和60份组织样本进行检测,共检测出14份阳性血清和10份阳性组织。这些结果表明本研究建立的基于TaqMan探针的PRRSV实时荧光定量PCR方法具有良好的特异性、灵敏度、重复性,可为临床检测PRRSV提供更高效的技术平台。; 吴海港饶品彬蔡晔全滟平姜永厚; 关键词：猪繁殖与呼吸综合症病毒 TAQMAN探针

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浙江省自然科学基金(Y3090166)