四川省教育厅青年基金(07ZB036)
- 作品数：3 被引量：5H指数：1
- 相关作者：袁青年四季黄黎王栩邬于川更多>>
- 相关机构：泸州医学院泸州医学院附属口腔医院更多>>
- 发文基金：四川省卫生厅科研基金四川省教育厅青年基金更多>>
- 相关领域：医药卫生更多>>
- 人TLR1胞外段原核表达载体的构建、蛋白表达及纯化
- 2010年
- 目的:克隆、原核表达人Toll-like receptor1(TLR1)胞外段基因,获得人TLR1胞外段蛋白。方法:RT-PCR扩增人TLR1胞外段基因,构建pET30(a)+/TLR1表达质粒,转染大肠杆菌BL21,在BL21细胞中表达TLR1胞外段蛋白,并进行纯化和Western blot鉴定。结果:PCR扩增及重组质粒测序结果表明成功地构建了pET30(a)+/TLR1胞外段原核表达质粒,PCR扩增的目的基因大小为1700bp左右。表达的包涵体蛋白经溶解及变性后上镍亲和柱纯化,SDS-PAGE分析纯化产物在Mr为68kD处有明显蛋白条带;Western blot及ELISA结果显示,其表达纯化的蛋白为TLR1蛋白。结论:TLR1胞外段在大肠杆菌BL21中正确表达,为TLR1识别机制及信号转导机制研究奠定了基础。
- 年四季李祥黄黎曹新梅周云刚袁青
- 关键词：原核表达纯化
- 人TLR1胞外段的克隆及测序分析被引量：1
- 2010年
- 目的构建人Toll样受体1(TLR1)胞外段原核表达质粒。方法采用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)从人外周血单个核细胞(PBMC)mRNA中扩增人TLR1胞外区cDNA;将扩增的目的基因与原核表达载体pET30a(+)质粒经NcoⅠ和NotⅠ双酶切后连接,转化E.coli BL21(DE3),筛选转化子,菌落PCR及测序验证克隆序列的正确性。结果测序结果表明,成功构建pET30a(+)-TLR1胞外区基因重组质粒,并转化感受态E.coli BL21(DE3)。结论 TLR1胞外段在大肠杆菌BL21中正确克隆,为TLR1信号通路的进一步研究打下了基础。
- 黄黎周丽珍年四季刘佳佳袁青
- 关键词：逆转录-聚合酶链式反应克隆
- 人源性天然噬菌体展示文库的构建及鉴定被引量：4
- 2010年
- 目的:构建人源性天然噬菌体展示文库并对文库进行鉴定。方法:从未经主动免疫健康志愿者的外周血淋巴细胞中提取总RNA,反转录合成cDNA,用直接PCR及半巢式PCR扩增人抗体重链(VH)及轻链(Vκ和Vλ)可变区基因。采用改进的重叠延伸PCR法将VH基因和VL(Vκ和Vλ)基因连接成人单链抗体(scFv)基因,并将scFv文库基因克隆到噬菌体载体pCANTAB-5E中,电转化E.coliTG1,构建单链抗体文库。结果:采用直接PCR和半巢式PCR扩增得到42条VH基因片段,16条Vκ基因片段,18条Vλ基因片段。混合的VH和VL等摩尔比连接后,产生的单链抗体文库基因大小为750bp左右;转化后构建了文库容量为1.35×108的单链抗体文库。BstNⅠ酶切分析文库中的单链抗体基因结果显示,酶切得到的scFv指纹图谱均不相同。结论:构建的抗体文库多样性好,可用于多种人源性单链抗体的筛选。
- 年四季黄黎王栩邬于川袁青
- 关键词：单链抗体重叠延伸PCR
