北京市自然科学基金(5051004)
- 作品数：7 被引量：42H指数：2
- 相关作者：杜立新尹春光李宏滨赵桂平张传生更多>>
- 相关机构：中国农业科学院北京畜牧兽医研究所济宁学院滨州医学院更多>>
- 发文基金：北京市自然科学基金国家高技术研究发展计划更多>>
- 相关领域：生物学农业科学更多>>
- 小鼠白血病抑制因子基因的克隆、表达及其对维持鸡原始生殖细胞未分化状态的影响
- 2008年
- 为了探索鸡原始生殖细胞(Primordial germ cells,PGCs)适合的培养体系,我们在已构建的分泌型真核表达载体pSecTag-mlif(sp-)的基础上,通过脂质体介导将mlif转染到鸡PGCs和鸡胚胎成纤维(Chicken embryonic fibroblast,CEF)细胞中,48h后收集细胞上清液,蛋白印迹均检测到小鼠白血病抑制因子(mLIF)的表达。以CEF细胞作饲养层,分七组来培养鸡PGCs,结果发现四组和五组培养的PGCs生长状态最好,三组传代后开始2-3天生长状况较好,3天后克隆周围有明显的分化现象。本实验将已构建了含mLIF基因的分泌型真核表达载体成功地瞬时转染到PGCs和CEF细胞中,且表达的mLIF具有维持鸡PGCs未分化状态的功能。
- 杨娜娜朱靖史卫峰孟春花杜立新
- 关键词：转染脂质体白血病抑制因子
- 鸡胚胎生殖细胞在鼠胚成纤维细胞饲养层上的生长被引量：8
- 2007年
- 目的:探讨以鼠胚成纤维细胞为饲养层分离、培养鸡胚胎生殖细胞的方法和条件。方法:分离、培养12.5～13.5d鼠胚成纤维细胞。分离孵化5.5d鸡胚原始生殖细胞,原代培养时不使用饲养层,与性腺基质细胞共培养;继代培养时将其置于鼠胚成纤维细胞饲养层上,在含生长因子、分化抑制因子的培养体系中培养胚胎生殖细胞。结果:鼠胚成纤维细胞可连续传代18代以上(4个月),3～15代细胞可以用作饲养层细胞。分离的鸡胚胎生殖细胞在饲养层上可增殖形成典型胚胎生殖细胞集落,并能连续在体外培养超过9代。集落未分化标志高碘酸希夫反应(PAS)呈强阳性,体外分化实验表明胚胎生殖细胞具有多能性。结论:用鼠胚成纤维细胞作为饲养层能获得可连续增殖的胚胎生殖细胞。
- 王娟孔祥华杜立新
- 关键词：胚胎生殖细胞细胞培养
- 鸡cENS-2基因U3-R序列的克隆分析与表达载体的构建被引量：1
- 2005年
- 克隆并测序了1.2 kb的鸡cENS-2(chicken normastem cell gene-2,cENS-2)基因3′端U3-R样结构调控序列。经序列分析和同源性比较表明,所克隆的U3-R序列包含多个转录因子结合位点如AP-1、GATA-1等,同时还包括一个重要的顺式调控元件B区,该区域在鸡正常的胚胎干细胞中有特异的增强子活性。该序列经pMD-18T载体过渡后,定向连接于切去启动子的pEGFP-N1载体的上游,构建了鸡cENS-2基因U3-R样序列调控的绿色荧光蛋白基因报告载体,为下一步对鸡胚胎干细胞(CES)细胞标记研究打下基础。
- 张传生耿立英杜立新
- 关键词：绿色荧光蛋白
- 基于Cre重组酶体系的鸡卵清蛋白基因打靶载体的构建被引量：2
- 2005年
- 利用胚胎干细胞基因打靶技术制备转基因鸡是研制鸡输卵管反应器的最佳技术路线。为建立基于Cre/loxp系统的鸡卵清蛋白基因(Ovalbumingene,OV)位点的双交换打靶载体系统,本研究克隆了鸡的OV基因7.8kb片段,并与克隆的内部核糖体进入位点(IRES)、人工合成的含有Cre重组酶识别位点变异体交换盒m2/loxp71EGFPloxp66,一起构建了含有Hsvtk负筛选标记的针对鸡卵清蛋白基因位点的敲入型共表达基因打靶载体pSSCm2/71EGFP66IRESOV7.8;以猪β干扰素基因(βInterferon,IFNβ)为目的基因构建了穿梭载体pMDm2/66MCSIFNMCSLoxp71,经过限制酶酶切及部分测序鉴定,所构建载体结构正确。进一步将它们共转化组成性表达Cre的细菌BM25.8。
- 张传生杜立新
- 关键词：基因打靶CRE重组酶RMCE转基因鸡打靶载体内部核糖体进入位点
- 中国部分地方鸡品种Mx基因部分区域多态性分析及表达研究
- ＜正＞引言Mx蛋白是在IFN诱导下产生的抗病毒蛋白,中国家禽Mx基因的多态性研究目前多集中在抗性位点631位氨基酸附近,本研究以8个中国地方品种和2个引进品种为素材探讨中外鸡种之间的Mx核苷酸变异及引起
- 尹春光杜立新赵桂平魏彩虹李宏滨王晓强
- 关键词：MX多态性
- 文献传递
- 鸡Mx基因的克隆与原核表达被引量：2
- 2009年
- 本研究旨在通过克隆鸡Mx全基因序列进而进行该基因的原核表达,获得具有生物学活性的蛋白。利用poly I:C诱导鸡胚成纤维细胞Mx基因表达,克隆了Mx基因全长cDNA序列,将开放阅读框(ORF)连接构建于表达质粒pGEX-4t-2中获得重组表达载体pGEX-Mx,转化Rosetta(DE3)菌株,经IPTG诱导后检测。表达产物检测显示该蛋白的相对分子量为75 ku。说明获得了Mx基因的高效表达,为进一步进行Mx基因的活性检测以及利用Mx蛋白进行抗病毒转基因的研究奠定了基础。
- 尹春光杜立新李善刚魏彩虹刘涛李宏滨赵桂平
- 关键词：MX蛋白克隆
- Mx基因稀有密码子和mRNA结构及大肠杆菌表达优化被引量：30
- 2009年
- 通过对稀有密码子和mRNA翻译起始区二级结构的分析,构建了4种重组表达菌株BL21(DE3)/pET-Mx,Rosseta(DE3)/pET-Mx,BL21(DE3)/pGEX-Mx和Rosseta(DE3)/pGEX-Mx,在大肠杆菌中进行Mx基因的表达,Rosseta(DE3)/pET-Mx和Rosseta(DE3)/pGEX-Mx重组表达菌中都获得了表达,Western blotting检测到了特异的75 kDa表达产物。实验结果证明稀有密码子和mRNA翻译起始区二级结构对Mx蛋白表达都有影响,选择适用于稀有密码子表达的菌株Rosetta(DE3)有利于Mx蛋白的表达,同时翻译起始区二级结构能值较低的表达载体pGEX-Mx获得的表达量明显增高。实验中首次获得了重组表达鸡全长Mx蛋白的大肠杆菌重组菌。
- 尹春光杜立新赵桂平李宏滨
- 关键词：MX蛋白翻译起始区稀有密码子
- 利用错配碱基产生酶切位点快速检测禽类Mx蛋白基因单核苷酸改变被引量：1
- 2008年
- 该方法针对无合适酶切位点的检测位点设计引物,应用于禽类Mx蛋白基因631位氨基酸位点的突变检测,利用错配碱基产生内切酶识别的酶切位点检测SNP,尝试一种操作简便结果可靠的检测单核苷酸多态性并能快速判定631位点氨基酸的方法。实验结果表明,利用这种方法产生的酶切位点能有效地对631位氨基酸位点进行分型,可以快速检测SNP。
- 尹春光李善刚路国彬杜立新
- 关键词：酶切位点SNP
