国家自然科学基金(30371260)
- 作品数：8 被引量：23H指数：3
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- 弓形虫酵母表达质粒pPIC9K-GRA1的构建及鉴定被引量：3
- 2007年
- 目的构建弓形虫致密颗粒抗原-1(GRA1)的酵母表达质粒,为进一步研究GRA1蛋白功能奠定基础。方法PCR扩增编码GRA1目的基因,用EcoRⅠ/NotⅠ分别对扩增产物和酵母表达质粒pPIC9K进行双酶切,将GRA1定向克隆到pPIC9K的EcoRⅠ/NotⅠ位点,对重组质粒进行PCR,双酶切初步鉴定后做序列测定。结果特异扩增出预期的GRA1片段,大小为573 bp,扩增产物经双酶切后成功连接到pPIC9K中,经PCR,双酶切及序列测定证明重组质粒中含有GRA1读框。结论成功构建弓形虫GRA1酵母真核表达质粒。
- 谢荣华吴翔舒衡平蒋立平范久波谭逵张琼
- 关键词：刚地弓形虫
- 弓形虫新基因表位疫苗质粒的构建及鉴定被引量：7
- 2007年
- 目的构建两个弓形虫新基因2B9G1、7C3-C3的表位疫苗质粒,为阐明表位疫苗的保护性奠定基础。方法采用生物信息学方法对新基因2B9G1、7C3-C3进行表位预测,PCR扩增基因中编码3个表位的片段W2b、W2a和W4a,连接入pcDNA3,转入DH5α,挑阳性菌落进行PCR、酶切和测序鉴定;同法将W2a、W4a分别克隆入pcDNA3-W2b载体中W2b片段下游,再将W4a克隆入pcDNA3-W2b2a载体中W2a片段下游。结果经PCR、酶切鉴定及序列测定,W2b、W2a和W4a 3个片段分别插入pcDNA3预期位置;W2a和W4a片段分别插入pcDNA3-W2b预期位置;W4a片段插入pcDNA3-W2b2a预期位置。结论成功构建单表位、双表位、多表位疫苗质粒pcDNA3-W2b、pcDNA3-W2a、pcDNA3-W4a、pcDNA3-W2b2a、pcDNA3-W2b4a、pcDNA3-W2a2b4a。
- 范久波吴翔谭逵谢荣华张琼蒋立平舒衡平
- 关键词：弓形虫新基因表位疫苗
- 弓形虫新基因wx2黄色荧光蛋白标记质粒的构建与鉴定被引量：1
- 2008年
- 目的构建弓形虫新基因wx2黄色荧光蛋白标记的黄色荧光超表达质粒,为进一步研究弓形虫新基因WX2的功能提供工具。方法采用PCR扩增出编码wx2目的基因,用BglII,AvrII分别对PCR扩增产物和ptubYFP-YFP/sagCAT进行双酶切。将wx2定向克隆到tubYFP-YFP/sag-CAT;对重组质粒进行PCR,双酶切初步鉴定后做序列测定。结果特异扩增出预计wx2目的基因片段,大小为558bp;扩增产物成功连接到ptubYFP-YFP/sagCAT中,经PCR,双酶切及序列测定结果表明重组质粒中含有基因wx2读框。结论成功构建弓形虫新基因wx2黄色荧光超表达质粒wx2-tub-YFP sag/CAT。
- 吴翔谭逵张琼谢荣华官剑武舒衡平
- 关键词：弓形虫重组质粒
- 弓形虫新基因表位疫苗免疫效果的观察被引量：5
- 2008年
- 目的观察弓形虫新基因WX、WX2的表位疫苗对小鼠的保护作用。方法将昆明小鼠分成5组,分别用pcDNA3-W2b、pcDNA3-W4a、pcDNA3-W2b4a质粒及pcDNA3和NS,肌注3次,每次间隔2周。免疫完成后ELISA法检测血清抗体水平,取脾细胞用流式细胞仪检测CD4+与CD8+淋巴细胞比值,PCR检测肌肉组织中重组质粒。免疫后第3周,小鼠经腹腔注射弓形虫速殖子500个,观察发病情况和存活时间。30d后仍存活的小鼠,取组织匀浆后进行小鼠盲传。结果免疫后第3周,pcDNA3-W2b组小鼠血清抗体水平显著高于pcDNA3和NS对照组(P<0.05);用PCR法从pcDNA3-W2b、pcDNA3-W4a和pcDNA3-W2b4a质粒组小鼠肌肉组织中成功检测到各表位疫苗质粒,且各组小鼠脾脏CD4+与CD8+T淋巴细胞比值显著低于pcDNA3组和NS组(P<0.05)。pcDNA3-W2b、pcDNA3-W2b4a组小鼠存活时间与pcDNA3组及NS组比较明显延长(P<0.05)。结论弓形虫新基因WX、WX2表位疫苗能够诱导小鼠产生抗弓形虫感染保护性免疫,提示DNA类表位疫苗的研制可作为弓形虫疫苗研究的策略之一。
- 范久波吴翔谭逵谢荣华张琼蒋立平舒衡平
- 关键词：弓形虫DNA表位疫苗质粒
- 弓形虫基因缺陷虫株建立方法的初步研究被引量：1
- 2008年
- 目的:应用电穿孔技术转染Tg P24基因敲除转染质粒于弓形虫RH,探讨电穿孔技术的应用条件,以及Tg P24基因敲除质粒转染虫株在不同哺乳动物细胞中筛选的最适条件。方法:设定所需的电穿孔参数、条件,如电压,电容,脉冲次数,电击杯的大小,电转染缓冲液,电穿孔后,将弓形虫悬浮液分别转移到长有不同贴壁细胞的培养瓶中,37℃,5%CO_2(体积分数)的培养箱中培养,观察弓形虫的生长状况,并对不同电穿孔参数、条件下的弓形虫存活率进行比较。12hr后换成加有福来霉素的完全培养基中选择培养,不同时间观察虫体及细胞生长情况;在细胞中选择培养10天后,收集虫体,4℃下福来霉素处理7天,再回复到细胞内用选择培养基培养5天,收集虫体,腹腔注射昆明小鼠,大量收集弓形虫用于提取RNA进行RT-PCR。结果:优化电穿孔条件后的弓形虫存活率得到提高(P<0.05);在选择浓度为5.0μg/ml-7.5μg/ml的福来霉素培养基中,筛选虫株采用L929细胞做为宿主细胞最为适合;RT-PCR结果显示L929细胞筛选基因敲除虫株的效果较好。结论:初步确定了弓形虫电穿孔技术的应用条件,以及TgP24基因敲除质粒转染虫株在不同哺乳动物细胞中的最佳筛选条件;获得了较好的转染效率,为进一步研究弓形虫TgP24基因敲除株的生物学特性打下了良好的基础。
- 谭逵张琼范久波谢荣华蒋立平官剑武舒衡平吴翔
- 关键词：弓形虫电穿孔基因敲除哺乳动物细胞
- MIC3-EGFP融合蛋白真核表达质粒的构建及其在COS-7细胞中的表达被引量：1
- 2008年
- 目的:构建以绿色荧光蛋白(greenfluorescenceprotein,GFP)为报告基因的重组表达质粒pEGFP-C2-MIC3并检测MIC3-EGFP融合蛋白其在COS-7细胞中的表达及定位。方法:通过基因重组的方法构建pEGFP-C2-MIC3重组真核表达质粒,并通过酶切和基因测序鉴定。脂质体法转染体外培养的COS-7细胞,转染后24h在活细胞状态下用倒置荧光显微镜直接观察MIC3-EGFP融合蛋白在COS-7细胞中的分布。结果:PCR检测,酶切鉴定及测序证实目的基因MIC3正确连接到pEGFP-C2的多克隆位点。pEGFP-C2-MIC3重组体转染COS-7后,在细胞质表达。结论:成功地构建了pEGFP-C2-MIC3融合蛋白真核表达质粒,在COS-7细胞中获得表达。
- 张琼谭逵蒋立平谢荣华范久波舒衡平吴翔
- 关键词：刚地弓形虫
- 弓形虫新基因wx2表位疫苗免疫小鼠的保护研究被引量：11
- 2008年
- 采用生物信息学方法对弓形虫新基因wx2进行表位分析预测,PCR扩增基因中编码2个表位的片段W2b和W2a,成功构建新基因的单表位疫苗质粒pcDNA3-W2b、pcDNA3-W2a和双表位疫苗pcDNA3-W2b2a,接种小鼠,观察表位疫苗的免疫保护作用.将表位疫苗分别通过肌肉注射免疫小鼠,对照组注射pcDNA3空质粒.ELISA法检测血清IgG抗体水平,取脾细胞用流式细胞仪检测T淋巴细胞亚群.各组小鼠末次免疫后第4周每只小鼠经腹腔注射弓形虫速殖子500个,观察小鼠的生存时间.结果显示,pcDNA3-W2a2b双表位疫苗组小鼠血清IgG抗体水平显著高于对照组(P<0.05),且pcDNA3-W2a2b双表位疫苗组小鼠脾细胞CD4+T与CD8+T淋巴细胞比值明显低于两单表位疫苗组,pcDNA3-W2a2b双表位疫苗组小鼠存活时间明显长于两单表位疫苗组(P<0.05).实验结果表明,弓形虫新基因wx2表位疫苗能够诱导小鼠产生抗弓形虫感染保护性免疫,并且弓形虫pcDNA3-W2b2a双表位疫苗的免疫保护性优于pcDNA3-W2b、pcDNA3-W2a两单表位疫苗.
- 谭逵张琼范久波谢荣华蒋立平吴翔舒衡平
- 关键词：弓形虫表位疫苗重组质粒B细胞表位保护力
