国家高技术研究发展计划(2001AA217171)
- 作品数：55 被引量：156H指数：7
- 相关作者：黄宗海俞金龙厉周苏国强李强更多>>
- 相关机构：南方医科大学中国人民解放军第一军医大学广州军区广州总医院更多>>
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- 相关领域：医药卫生更多>>
- KDR介导的双自杀基因重组腺病毒对ECV304细胞增殖活性、细胞周期及凋亡的影响被引量：1
- 2005年
- 目的探讨腺病毒介导KDR启动子驱动的融合基因体系对人脐血管内皮细胞株ECV304的增殖活性、细胞周期及凋亡的影响。方法以重组腺病毒AdEasy-KDR-CDglyTK体外感染表达KDR的ECV304细胞株和对照组不表达KDR的LS174T细胞株,并给予不同浓度的前药GCV(ganciclovir)和/或5-FC(5-fluorocytosine),观察该体系对ECV304细胞的杀伤效应及其旁观者效应;并以流式细胞仪检测细胞周期的变化,电镜观察细胞的病变。结果重组腺病毒对ECV304细胞及对照组LS174T细胞的感染率相似,其感染率随腺病毒滴度的递增而增加,当MOI为200时,所有细胞株均达约100%感染。以MOI为100的重组体分别感染各细胞株表现出对前药的不同敏感性:表达KDR的ECV304细胞对前药的具有较高的敏感性,与前者相比,不表达KDR的LS174T细胞对前药不敏感(P均<0.001)。融合基因的疗效优于任一单自杀基因(P均<0.001)。将感染腺病毒的细胞与未感染细胞以不同混合培养,观察到该体系明显的旁观者效应。流式细胞术检测表明该体系抑制ECV304细胞DNA的合成,表现为S期细胞比率增多及G1期细胞减少(P均<0.001)。同时,电镜下可见ECV304有凋亡和坏死改变。结论KDR基因启动子可调控融合基因体系选择性杀伤人血管内皮细胞,其机制与细胞周期阻滞、凋亡及坏死有关。
- 苏国强黄宗海俞金龙厉周范应方宋慧娟王蔚张进华
- 关键词：KDR启动子自杀基因治疗腺病毒
- 双自杀基因重组腺病毒对胃癌细胞及血管内皮细胞的体外特异性杀伤作用
- 2005年
- 目的研究腺病毒介导的KDR启动子驱动CD/TK融合基因(AdKDR-CDglyTK)对胃癌细胞及血管内皮细胞的选择性杀伤作用。方法选择表达KDR的MGC803细胞、ECV304细胞和不表达KDR的LS174T细胞,用腺病毒重组体AdEasy-KDR-CDglyTK和AdEasy-CMV-CDglyTK感染之,观察其感染效率并以RT-PCR方法检测转基因细胞CDglyTK的表达,然后给予不同浓度的前药5-FC及GCV处理,观察该体系对不同细胞株的杀伤效应。结果两种重组体对各细胞株的感染率相似,其感染率随腺病毒滴度的增高而递增。RT-PCR检测发现:除感染AdKDR-CDglyTK的LS174T细胞外,感染AdCMV-CDglyTK的所有细胞及感染AdKDR-CDglyTK的MGC803细胞、ECV304细胞均有目的基因CDglyTK的表达。以感染复数为100的两种腺病毒分别感染各细胞株,其表现出对前药不同的敏感性:感染AdCMV-CDglyTK的所有细胞株和感染AdKDR-CDglyTK的MGC803细胞、ECV304细胞对前药具有较高的敏感性,且其敏感性差异无显著性意义(P>0.1);相比之下,感染AdKDR-CDglyTK的LS174T细胞对前药不敏感(P<0.001)。双自杀基因的疗效优于任一单自杀基因的疗效(P<0.001)。将感染腺病毒的细胞与未感染细胞以不同比例混合培养,观察到该体系明显的旁观者效应。结论KDR基因启动子可调控双自杀基因系统选择性杀伤表达KDR胃癌细胞及血管内皮细胞。
- 黄宗海苏国强俞金龙厉周范应方周广军宋慧娟
- 关键词：血管内皮KDR启动子自杀基因治疗腺病毒
- VEGF启动子介导双自杀基因重组腺病毒对LoVo细胞的体外杀伤作用被引量：4
- 2005年
- 目的探讨VEGF启动子驱动的CD/TK双自杀基因重组腺病毒(Ad-VEGFp-CDglyTK)对大肠癌LoVo细胞的体外杀伤作用。方法分别用重组腺病毒Ad-VEGFp-CDglyTK、Ad-CMV-CD、Ad-CMV-TK、Ad-CMV-CDglyTK转染大肠癌LoVo细胞,给予前药5-FC、GCV,测定LoVo细胞的集落形成、细胞存活率及该治疗系统的旁观者效应。结果与Ad-CMV-CD、Ad-CMV-TK相比,Ad-VEGFp-CDglyTK系统对LoVo细胞的集落形成、细胞生长均具有更强抑制作用,并可见较明显的旁观者效应。而与CMV启动子的双自杀基因相比,其作用无显著性差异。结论VEGF启动子驱动的双自杀基因治疗系统对大肠癌LoVo细胞有确切的杀伤作用,其作用强度与强启动子CMV驱动的双自杀基因治疗系统相似。
- 黄宗海陈建雄苏国强
- 关键词：结直肠肿瘤自杀基因腺病毒
- 血管内皮生长因子受体启动子驱动重组腺病毒双自杀基因系统选择性杀伤大肠癌细胞被引量：7
- 2005年
- 目的探讨血管内皮生长因子受体(KDR)启动子驱动重组腺病毒CDglyTK融合基因体系对结直肠癌细胞株LOVO及人脐血管内皮细胞株ECV304的选择性杀伤作用。方法将质粒pAdEasy-KDR-CDglyTK在293细胞内包装、扩增后,体外感染表达KDR的LoVo、ECV304细胞和对照组不表达KDR的LS174T细胞,并给予不同浓度的前药GCV(ganciclovir)和/或5-FC(5-fluorocytosine),观察该体系对细胞株的杀伤效应。结果制备的病毒滴度为2.0×1012pfu/ml。3种细胞的感染率相似,且感染率随腺病毒滴度的递增而增加,当MOI为200时,所有细胞株均接近100%感染。以MOI为100的重组体分别感染各细胞株,发现其对前药的敏感性不同:表达KDR的LoVo和ECV304细胞对前药具有较高的敏感性,且二者敏感性无显著差异(P>0.1);与前二者相比,LS174T细胞对前药不敏感(P<0.001)。同时,CDglyTK双自杀基因的疗效优于任一单自杀基因(P<0.001)。流式细胞术检测表明该体系抑制LoVo细胞DNA的合成,表现为S期细胞比率增多及G1期细胞减少(P<0.001)。结论KDR基因启动子调控的CDglyTK融合基因体系可选择性杀伤结直肠癌LoVo细胞和血管内皮细胞。
- 林荣凯黄宗海苏国强柯志勇陈建雄周俊杰
- 关键词：血管内皮KDR启动子自杀基因治疗
- 双自杀基因重组腺病毒对胰腺癌细胞SW1990的体外杀伤作用被引量：1
- 2008年
- 目的研究腺病毒介导的血管内皮生长因子（VEGF）启动子驱动胞嘧啶脱氨酶（CD）／胸苷激酶（TK）融合基因系统（Ad—VEGFP—CDTK）对胰腺癌细胞SW1990增殖的影响。方法重组腺病毒体外感染表达VEGF的SW1990细胞株，用空腺病毒做对照，观察其感染效率并以RT-PCR、Western blot方法检测转基因细胞CDTK的表达，MTY法观察该体系对SW1990细胞生长增殖的影响及其旁观者效应；电镜观察细胞的病变；流式细胞仪检测细胞周期的变化和DNA含量的变化；分光光度法检测细胞内caspase-3活性。结果两种腺病毒对细胞株的感染率相似。RT-PCR和Western blot检测发现转染Ad—VEGFP-CDTK的细胞有目的基因和蛋白的表达。MTY法检测显示前药呈剂量依赖性抑制SW1990生长，且观察到该体系明显的旁观者效应。电镜下可见SW1990有凋亡改变。用流式细胞仪测定用药组出现典型的凋亡峰；细胞周期分析显示治疗后细胞G0-G1期比率增多，G2-M及S期细胞减少。随着前药浓度的升高转基因细胞内caspase-3活性逐渐升高。结论VEGF启动子可调控双自杀基因体系抑制胰腺癌细胞SW1990增殖，并且诱导胰腺癌细胞凋亡。
- 黄宗海孔恒闫振宇陈旭
- 关键词：胰腺肿瘤腺病毒
- KDR启动子驱动的双自杀基因对人结肠癌细胞的特异性杀伤作用被引量：1
- 2010年
- 目的探讨腺病毒介导的KDR启动子驱动的双自杀基因系统CDglyTK对人结肠癌细胞SW480的特异性杀伤作用。方法用腺病毒AdKDR-CDglyTK感染表达KDR的SW480细胞和不表达KDR的LS174T细胞,观察其感染效率并以RT-PCR方法检测重组腺病毒及转基因细胞CDglyTK的表达,然后给予不同浓度的前药5-FC及GCV处理,MTT法检测该系统对不同细胞株的杀伤效应和旁观者效应;用流式细胞术观察细胞内DNA含量和细胞周期的变化。结果携带双自杀基因和报告基因(GFP)的重组腺病毒载体,感染复数为100时,95%以上的受感染SW480和LS174T细胞中有GFP表达。RT-PCR检测发现SW480细胞有目的基因的表达,而LS174T细胞无表达。在前药应用下,已转染腺病毒的SW480和LS174T细胞表现出对前药不同的敏感性:表达KDR的SW480细胞对前药具有较高的敏感性,而不表达KDR的LS174T细胞对前药不敏感(P<0.01)。将感染腺病毒的细胞与未感染细胞以不同比例混合培养,观察到该系统有明显的旁观者效应。用流式细胞仪测定给药组出现典型的凋亡峰,细胞周期显示治疗组细胞G0-G1期比率增多,S期细胞减少。结论KDR启动子可调控双自杀基因体系选择性杀伤人结肠癌SW480细胞,抑制其增殖并诱导细胞凋亡。
- 王朝阳黄宗海李强姚晓军俞金龙历周
- 关键词：人结肠癌细胞KDR启动子自杀基因
- 应用AdEasier-1系统高效制备含VEGFP驱动TK自杀基因的重组腺病毒被引量：7
- 2004年
- 背景及目的:自杀基因疗法的瓶颈之一是自杀基因在肿瘤细胞的特异性表达水平低。利用肿瘤特异性启动子来调控自杀基因使其在肿瘤细胞中特异性表达已成为肿瘤自杀基因研究的热点。研究证实血管内皮生长因子在绝大多数实体瘤细胞中都有过量表达而在正常组织中不表达或表达甚微,其过量表达与血管内皮生长因子启动子(vascularendothelialgrowthfactorpromoter,VEGFP)活性上调有关。为研究VEGFP可否提高TK自杀基因在肿瘤细胞的特异性表达水平,本研究应用一种高效的重组腺病毒构建系统,即AdEasier-1系统制备含VEGFP驱动TK自杀基因的重组腺病毒。方法:VEGFP自pEGFP-1-SV-VEGFP切下后插入pAdtrack载体上构建pAdtrack-VEGFP。用HindⅢ/XbaⅠ自pREP8-TK切出带polyA加尾信号的TK基因,亚克隆到pAdtrack-VEGFP中构建转移质粒pAdtrack-VEGFP-TK。PmeⅠ酶线性化转移质粒pAdtrack-VEGFP-TK,转化含腺病毒基因组质粒pAdEasy-1的细菌AdEasier-1,用25μg/ml卡那霉素筛选阳性克隆,先后进行琼脂糖电泳和PacⅠ酶切鉴定,筛选出正确重组腺病毒质粒pAdEasy-VEGFP-TK,经293细胞包装、扩增获得重组腺病毒Ad-VEGFP-TK,行酶切鉴定、PCR鉴定和测序。结果:卡那霉素抗性细菌只有两种,一种含pAdEasy-VEGFP-TK(大于33kb)。
- 陈建发黄宗海黄元媛宋慧娟车小燕
- 关键词：肿瘤重组腺病毒自杀基因治疗血管内皮生长因子
- 5-氨基乙酰丙酸介导的光动力学治疗胃癌的实验研究(英文)被引量：3
- 2006年
- 目的探讨5-氨基乙酰丙酸(5-ALA)介导的光动力学对人胃癌细胞MGC-803的治疗作用。方法将不同浓度的5-ALA加入细胞培养基中,随之给予相同剂量的激光辐射;之后用固定浓度的5-ALA处理细胞,并给予不同剂量的激光辐射。MTT法测定细胞生存率。结果在相同的辐射剂量下,经0.25、0.5、1.0、2.0、4.0 mmol/L的5-ALA处理的细胞生存率分别为(70.07±5.37)%、(50.04±4.99)%、(34.53±5.30)%、(26.89±4.44)%和23.90%±2.80%,除2.0和4.0 mmol/L5-ALA两组间外,其余各组间具有显著性差异(F=266.39,P<0.001)。在相同的5-ALA的浓度下,辐射剂量为6.25、12.5、25.0、50.0、100 J/cm2的细胞生存率分别为(83.50±10.43)%、(67.96±9.23)%、(33.80±8.26)%、(23.31±5.98)%和(14.96±3.50)%,各组之间有显著性差异(F=226.31,P<0.0001)。而单用5-ALA处理细胞,对应于其浓度为0.25、0.5、1.0、2.0,和4.0 mmol/L时的细胞生存率分别为(96.46±6.72)%、(97.48±5.27)%、(98.33±6.67)%、(99.47±6.97)%和(95.66±7.72)%,各浓度之间无显著性差异(F=0.79,P=0.5383)。单纯激光辐射,其剂量为6.25、12.5、25.0、50.0、100.0 J/cm2时的细胞生存率也无显著性差异(F=0.61,P=0.6551)。结论在较低的浓度范围内,5-ALA介导的光动力学治疗对人胃癌MGC-803细胞的杀伤作用随着5-ALA浓度的增加而增加,在较高浓度时则存在饱和现象,杀伤力与光剂量成正比。单纯激光不能产生光动力效应,5-ALA本身对细胞无毒性作用。5-ALA介导的光动力学治疗是很有希望的胃癌治疗方法。
- 黄宗海周广军俞金龙厉周丁涟沭徐如祥姜晓丹
- 关键词：胃癌5-氨基乙酰丙酸5-ALA光动力学治疗MGC-803细胞
- AdKDR-CDglyTK融合基因系统对胃癌MGC-803细胞体的外杀伤作用被引量：1
- 2006年
- 目的探讨腺病毒介导血管内皮生长因子第二受体,亦即酪氨酸激酶受体(kinase domain-containing receptor,KDR) 启动子驱动的CDglyTK融合基因体系对人胃癌细胞株MGC-803的杀伤作用。方法将质粒pAdEasy-KDR-CDglyTK 在293细胞内包装、扩增后,体外感染表达KDR的MGC-803细胞株,并给予不同浓度的前药5-FC和／或更昔洛韦,观察该体系对MGC-803细胞株的杀伤效应及其旁观者效应;并以流式细胞仪检测细胞周期的变化,电镜观察细胞的病变。结果所得病毒滴度为2．0×1012pfu／ml。MGC-803细胞株感染率随腺病毒滴度的递增而增加。融合基因的疗效优于任一单自杀基因(P<0．001)。将感染腺病毒的细胞与未感染细胞以不同比例混合培养,观察到该体系明显的旁观者效应。流式细胞术检测表明该体系抑制MGC-803细胞DNA的合成,表现为G1期细胞比率增多及S期细胞减少(P<0．001)。同时,电镜下可见MGC-803细胞有凋亡和坏死改变。结论腺病毒介导KDR启动子驱动的CDglyTK融合基因体系可以有效地杀伤人胃癌细胞。
- 周广军黄宗海俞金龙厉周苏国强
- 关键词：KDR启动子自杀基因治疗
- 应用两步氯化钙转化法高效制备双自杀基因重组腺病毒被引量：3
- 2003年
- 目的构建巨细胞病毒(CMV)启动子驱动下的双自杀基因重组腺病毒。方法应用PCR扩增出CD和TK基因,经适当改造后插入pAdtrack CMV中构建成转移质粒pAdtrack CMV-CDTK,经酶切线性化后,转化用氯化钙制备的感受态AdEasier-1细菌,获得重组腺病毒质粒。最后将线性化的重组腺病毒质粒转染293细胞包装获得重组腺病毒,滴度测定后,体外感染血管内皮细胞ECV304。结果PCR检测表明已成功构建了含CD、TK融合基因的重组腺病毒,为进一步开展肿瘤的双自杀基因治疗研究奠定了基础。结论应用改进后的AdEasy系统构建腺病毒相比于传统AdEasy系统,方法更简便、成功率更高、实验周期更短。
- 郑权黄宗海汤福祥黄媛媛车小燕
- 关键词：基因治疗
