上海市科学技术委员会基础研究重点项目(02JC14029)
- 作品数：18 被引量：58H指数：4
- 相关作者：梅长林孙田美赵海丹张树忠戴兵更多>>
- 相关机构：第二军医大学医学部中国人民解放军海军总医院更多>>
- 发文基金：上海市科学技术委员会基础研究重点项目国家自然科学基金国家科技重大专项更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 多囊蛋白1胞内区单克隆抗体的制备及初步应用被引量：1
- 2003年
- 目的 :制备多囊蛋白 1胞内区单克隆抗体 ,并用以观察多囊蛋白 1在肾组织中的分布与表达。 方法 :以重组多囊蛋白 1胞内段融合蛋白为抗原 ,采用杂交瘤技术 ,制备产生针对多囊蛋白 1胞内区的单克隆抗体的杂交瘤细胞株 ,并利用所产生的单克隆抗体 ,采用标准 En Vision免疫组织化学方法 ,对多囊肾组织、正常成人肾组织和胎肾组织进行染色。结果 :获得 4株稳定分泌抗体且效价为 1∶ 10 6 左右的杂交瘤细胞株 ,传代至第 5 0代仍能稳定分泌抗体 ,效价不变 ;多囊蛋白 1在正常成人肾组织的近端小管、远端小管和集合管的上皮细胞呈弱阳性表达 ,在胎儿肾脏的肾小管上皮细胞呈强阳性 ,在多囊肾组织的囊肿衬里上皮细胞表达明显增强。 结论 :成功制备了多囊蛋白 1胞内区单克隆抗体 ,为深入了解多囊蛋白
- 郑瑞英梅长林万谟彬孙卫民
- 关键词：单克隆抗体基因表达多囊肾病
- 常染色体显性遗传性多囊肾病囊肿液对肾小管上皮细胞增殖和凋亡的影响被引量：2
- 2003年
- 目的 :观察常染色体显性遗传性多囊肾病 (ADPKD)囊肿液对肾小管细胞增殖、凋亡以及细胞周期的影响 ,以初步探讨 ADPKD囊肿发生、发展的机制。 方法 :用不同浓度的 ADPKD囊肿液处理 MDCK和 L L C- PK1 两株肾小管细胞 ,采用MTT法观察细胞增殖 ,用流式细胞术检测细胞周期和凋亡指数。 结果 :(1)与对照组相比 ,不同浓度 (10 %、2 0 %、4 0 %、6 0 % ,V/ V) ADPKD囊肿液作用 2 4 h能明显促进上述两株肾小管细胞增殖 ,并呈剂量依赖性 ;而且明显影响细胞周期 ,使 G0 ～ G1 期细胞增多、S期细胞减少。 (2 )高浓度 (40 %、6 0 % ) ADPKD囊肿液作用 4 8h对 MDCK细胞仍有上述作用 ,但对 L L C- PK1 细胞则无类似作用。 (3)不同浓度 ADPKD囊肿液均不诱导上述两株细胞凋亡。结论 :ADPKD囊肿液可剂量依赖性地促进肾小管细胞增殖 ,并在 2 4 h达作用高峰 ,但并不诱导肾小管细胞凋亡 ,其机制可能与囊肿液通过激活 G1 期细胞 ,使细胞未从 G1
- 孙田美张树忠梅长林汤兵戴兵张殿勇李林
- 关键词：多囊肾病常染色体显性肾小管细胞增殖凋亡
- 角质细胞生长因子在常染色体显性遗传性多囊肾病囊肿组织中的表达定位被引量：1
- 2003年
- 目的 :在蛋白水平研究角质细胞生长因子 (keratinocyte growth factor,KGF)在常染色体显性遗传性多囊肾病 (auto-somel dominant polycystic kidney disease,ADPKD)囊肿组织中的表达及定位。方法 :分别采用蛋白质印迹及免疫组化方法分析 ADPKD患者囊肿组织中 KGF的表达和进行细胞定位。 结果 :与正常肾组织相比 ,ADPKD患者的囊肿组织 KGF含量明显增高 ,约是前者的 4倍 ,主要在囊肿衬里上皮细胞和残存的正常肾小管上皮细胞中表达。 结论 :KGF在 ADPKD囊肿组织局部的过度表达可能是 ADPKD囊肿形成和发展的重要因素之一。
- 刘沙勤梅长林孙田美盛茂
- 关键词：角质细胞生长因子多囊肾病常染色体显性囊肿
- 多囊蛋白1表达载体的构建及表达被引量：4
- 2003年
- 目的 :体外表达并纯化多囊蛋白 1胞外区片段。方法 :提取健康人肾组织总 RNA,用一步法 RT- PCR选择扩增编码多囊蛋白 1胞外多拷贝区的 2个 c DNA片段 ,并将之克隆到融合蛋白表达载体 p QE30中 ,转染含有阻遏质粒 p REP4的大肠杆菌 M15。异丙基硫代半乳糖苷 (IPTG)诱导表达融合蛋白 ,用亲和层析法纯化。纯化产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳及蛋白质印迹分析鉴定。 结果 :克隆到 2个编码多囊蛋白 1胞外区的 c DNA片段 ,其大小分别为 5 0 2 bp和 4 71bp。构建的表达质粒p QE30 - PK D1e1和 p QE30 - PK D1e2经限制性内切酶酶切和 DNA测序证实为所需要的质粒。表达出相对分子质量分别为19 80 0、1890 0的融合蛋白 ,经蛋白质印迹分析鉴定为多囊蛋白 1的融合蛋白。结论 :本实验克服了 PK D1基因在体内多个同源序列的干扰 ,克隆了编码多囊蛋白 1胞外多拷贝区的 c DNA序列 ,并成功地获得了融合表达的目的蛋白 ,为进一步制备抗多囊蛋白
- 赵海丹梅长林孙田美张树忠
- 关键词：多囊肾病常染色体显性融合蛋白
- PKD2基因在正常人和2型常染色体显性遗传性多囊肾病患者肾组织中的表达
- 2003年
- 目的 :观察 PK D2基因在正常人和 2型常染色体显性遗传性多囊肾病 (ADPKD)患者肾组织中的不同表达 ,探讨多囊肾病的发病机制。 方法 :抽提正常人肾组织细胞总 RNA ,通过 RT- PCR法获得 PK D 2基因第 12～ 13外显子 c DNA片段 ,以此为探针 ,用地高辛标记 ,对正常人和 2型 ADPKD患者肾组织分别进行原位杂交 ,并结合图像分析系统观察 PK D2基因表达情况。 结果 :正常人肾组织中 PK D2基因在 Henle襻的厚升支、远曲小管和皮质集合管有较强的表达 (平均光密度为 1.2 3± 0 .0 4 ) ;而 2型ADPKD患者肾组织中 PKD2基因仅在部分囊壁中有少量表达 (平均光密度为 0 .5 6± 0 .0 3)。 结论 :正常人肾组织中 PK D2基因表达量明显高于 2型 ADPKD患者 ,提示 PK D2基因表达降低在 2型
- 周玉坤梅长林孙田美沈学飞宋吉
- 关键词：多囊肾病常染色体显性原位杂交PKD2基因
- 上海市汉族人群与PKD1基因紧密连锁的微卫星DNA的多态性分析被引量：5
- 2003年
- 目的 :研究与多囊肾病 PK D1基因紧密连锁的 4个微卫星 DNA的多态性 ,为家系连锁分析和临床分子诊断提供有用的遗传标记。方法 :抽提上海市 80名汉族无关个体 (均为健康志愿者 )的 DNA,对其进行 4个微卫星位点 (KG8、SM6、CW2和 SM7)的 PCR扩增 ,采用毛细管电泳法分离 PCR扩增产物 ,用 Gene Scan TM、Genotyper TM软件对其进行基因分型。结果 :在上海市汉族人群中 ,发现 KG8、SM6、CW2、SM7分别有 4、10、11和 9个等位基因片段 ,其杂合度和多态信息含量分别为 0 .2 9和 0 .2 74、0 .82 5和 0 .819、0 .786和 0 .779、0 .85和 0 .82 7,群体分布符合 Hardy- Weinberg平衡。结论 :微卫星位点 SM6、CW2、SM7具有较高的杂合度和多态信息含量 。
- 张维莉梅长林吴玉梅张殿勇孙田美宋吉
- 关键词：多囊肾病常染色体显性微卫星DNA多态信息含量
- 基因扫描微卫星DNA进行常染色体显性遗传性多囊肾病囊肿前诊断被引量：4
- 2003年
- 目的 :利用与多囊肾病 PK D1基因紧密连锁的微卫星 DNA,通过家系连锁分析 ,进行常染色体显性遗传性多囊肾病 (ADPKD)的囊肿前诊断 ,为临床分子诊断奠定基础。 方法 :采用 PCR-基因扫描的方法 ,对 4个 ADPKD家系共 39人进行连锁分析。 结果 :通过连锁分析 ,发现 4个家系中 1名 16岁个体为 PK D1突变携带者 ,处于囊肿发生前期。 结论 :基因扫描微卫星 DNA是一种快速、准确的基因分型方法 ,可用于
- 张维莉梅长林孙田美张殿勇张树忠吴玉梅汤兵戴兵
- 关键词：多囊肾病常染色体显性微卫星DNA分子诊断
- 4-羟苯基维甲酸诱导常染色体显性遗传性多囊肾病囊肿衬里上皮细胞凋亡被引量：1
- 2003年
- 目的 :探讨 4 -羟苯基维甲酸 (4- HPR)诱导常染色体显性遗传性多囊肾病 (ADPKD)囊肿衬里上皮细胞凋亡的作用及其机制。方法 :采用 MTT法检测 1、2 .5、5、10μmol/ L 4 - HPR分别作用 ADPKD囊肿衬里上皮细胞 2 4、4 8、72、96 h后细胞的增殖情况 ;采用锥虫蓝染色、DNA电泳、Hoechst 33342染色检测 4 - HPR作用后的肝细胞生长因子 (HGF)刺激的 ADPKD囊肿衬里上皮细胞的存活率和凋亡率 ;采用免疫组化及半定量分析检测 4 - HPR对 HGF刺激的囊肿衬里上皮细胞表达 HGF和c- Myc蛋白的作用。结果 :与对照组比较 ,4 - HPR抑制了 ADPKD囊肿衬里上皮细胞增殖 ,且呈量效和时效关系 ,5 μmol/ L 或10 μmol/ L 4 - HPR作用 96 h后抑制效果最强 (P<0 .0 1)。 4 - HPR显著降低 HGF刺激的囊肿衬里上皮细胞的存活率 ,且诱导细胞凋亡 ,与对照组比较差异显著 (P<0 .0 1)。与 HGF组比较 ,4 - HPR显著降低 HGF刺激的囊肿衬里上皮细胞表达 HGF蛋白 (P<0 .0 1) ,但不影响表达 c- Myc蛋白。 结论 :4 - HPR诱导了 HGF刺激的 ADPKD囊肿衬里上皮细胞凋亡 ,其机制可能通过降低 HGF刺激的 ADPKD囊肿衬里上皮细胞表达 HGF蛋白 ,不是影响 c-
- 原爱红梅长林等
- 关键词：维甲酸多囊肾病常染色体显性囊肿衬里上皮细胞凋亡
- 牛磺酸抑制血小板衍生生长因子诱导的系膜细胞增殖及细胞外基质分泌被引量：2
- 2003年
- 目的 :观察牛磺酸对血小板衍生生长因子 (PDGF)诱导的系膜细胞增殖及细胞外基质分泌的影响 ,并探讨其作用的可能机制。 方法 :体外传代培养的大鼠系膜细胞 ,经一定量的牛磺酸和 (或 ) PDGF作用 4 8h后 ,用噻唑蓝 (MTT)法检测细胞增殖 ,流式细胞术检测细胞周期 ,EL ISA方法检测细胞外基质 ( 型胶原及层粘连蛋白 )含量 ,免疫细胞化学方法检测 C- jun、C- fos的表达。 结果 :与对照组比较 ,10、2 0 ng/ ml PDGF可明显促进系膜细胞增殖 ,影响细胞周期 ,使 G0 ～ G1 期细胞减少 ,S期细胞增加 ,并能明显促进细胞外基质的分泌及 C- jun、C- fos的表达 (P<0 .0 1) ,而 2 0或 4 0 mm ol/ L 牛磺酸作用于系膜细胞后 ,可明显抑制 PDGF(2 0 ng/ ml)诱导的细胞增殖、细胞外基质分泌及 C- jun、C- fos的表达。 结论 :牛磺酸对 PDGF诱导的系膜细胞增殖及细胞外基质分泌有显著抑制作用 ,其机制可能与牛磺酸抑制 C- jun、C-
- 孙田美赵海丹徐成钢李林盛茂梅长林
- 关键词：牛磺酸血小板衍生生长因子系膜细胞细胞增殖细胞外基质
- 表皮生长因子受体蛋白酪氨酸激酶的表达、纯化及活性测定被引量：3
- 2004年
- 目的:采用原核表达体系对表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)受体型酪氨酸激酶(recep-tor tyrosine kinase,RTK)进行体外表达、纯化及活性鉴定。方法:以包含EGFR cDNA的pRK5质粒为模板,PCR选择扩增编码EGFR-RTK的cDNA片段,插入pQE30质粒后转染大肠杆菌M15。IPTG诱导表达融合蛋白,包涵体蛋白经复性后亲和层析法纯化,ELISA方法测定蛋白活性。结果:成功地将933 bp的EGFR-RTK cDNA片段插入载体pQE30中,构建了表达载体pQE30-RTK。经诱导在原核表达系统中以包涵体形式高效表达了相对分子质量为37 000的EGFR-RTK融合蛋白,表达量约占菌体总蛋白的65.2％。复性、纯化后的EGFR-RTK蛋白经ELISA检测,结果发现随着加入蛋白量的增加,酶促反应产物磷酸化酪氨酸的量也逐渐增加,两者具有线性关系。结论:本实验成功地利用原核表达系统表达了具有生物学活性的EGFR-RTK,较传统的昆虫细胞表达系统更为简便、经济。
- 李林赵海丹李国伟陈静沈旭梅长林
- 关键词：表皮生长因子受体酪氨酸激酶基因表达
