国家自然科学基金(30371318)
- 作品数：9 被引量：23H指数：3
- 相关作者：王丕龙向廷秀黄爱龙陶小红姜政更多>>
- 相关机构：重庆医科大学附属第一医院重庆医科大学重庆医科大学附属第二医院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金重庆市卫生局科研项目更多>>
- 相关领域：生物学医药卫生农业科学更多>>
- 重组耻垢分枝杆菌制剂预防幽门螺杆菌感染的作用机理的初步探讨被引量：3
- 2007年
- 目的探讨重组耻垢分枝杆菌实验制剂（recombinant Mycobacterium smegmatis，rMs）预防幽门螺杆菌（Helicobacter pylori，Hp）感染的作用机理。方法实验制剂免疫BLAB／c小鼠4周，用Hp攻击后4周，取血清、胃、脾组织，RT-PCR检测小鼠胃黏膜和脾组织的TH1型细胞因子（IFN-γ、IL-2、IL-12）与TH2型细胞因子（IL-4、IL-6、IL-10）；用ELISA检测针对唧的特异性血清IgG、IgG1、IgG2a和IgA水平；用免疫组化方法检测胃黏膜固有层IgA表达；用MTT检测脾淋巴细胞增殖。结果免疫后BALB／c小鼠特异性抗体显示rMs制剂诱导Hp特异性血清IgG、IgA水平都升高，以IgG2a占优势。用Hp抗原刺激后各免疫组小鼠脾淋巴细胞均有明显增殖。免疫组化显示各免疫组小鼠胃黏膜固有层IgA阳性标记腺体数明显高于对照组。RT-PCR证实，跏攻击之前，各免疫组胃和脾组织已出现了IFN-γ、IL-12、IL-2表达而无IL-4、IL-6、IL-10表达。PBS对照组和单纯耻垢分枝杆菌（Ms）组胃黏膜和脾组织各细胞因子均无表达；Hp攻击后，PBS和单纯Ms组胃组织出现以TH1细胞IFN-γ为主的增生，IFN-γ水平显著高于rMs组（P〈0．05）；而3个rMs制剂组脾脏则出现以TH2细胞（IL-4）为主的增生，IL-4水平显著高于对照组（P〈0．05）。提示该制剂的作用机制是诱导TH1，TH2平衡型免疫应答。结论成功地建立了BALB／c小鼠的Hp感染模型，对rMs制荆的免疫保护机理研究结果显示，rMs能产生以TH1细胞和TH2细胞协同作用的保护性免疫应答。
- 向廷秀谯敏姜政黄爱龙陶小红王丕龙赖国旗
- 关键词：幽门螺杆菌
- 人幽门螺杆菌18000外膜蛋白与HspA双价疫苗的构建和表达被引量：13
- 2004年
- 目的 :构建含人幽门螺杆菌 (Hp)热休克蛋白A(HspA)和Mr为 180 0 0的外膜蛋白编码基因的重组载体 ,进行核苷酸序列分析 ,并在E .coliBL2 1中表达。方法 :用PCR方法从HpDNA染色体中 ,扩增HspA编码基因片段。将目的基因HspA与载体 pET32a(+)分别经kpnⅠ和BamHI双酶切后 ,进行连接、测序。同时将重组载体 pET32a(+) /HspA和pET32a(+) /Omp18,分别经HindIII和BamHI双酶切 ,通过凝胶电泳回收pET32a(+) /HspA和Mr180 0 0OMPDNA片段 ,经T4连接酶将HspA和Mr180 0 0OMP编码基因通过酶切粘端进行连接 ,而后转化并筛选含有两种目的基因的重组载体 ,并在大肠杆菌BL2 1(DE30 )中表达。表达产物经Ni NTA琼脂糖树脂纯化后 ,以Westernblot分析其抗原性。结果 :经酶切、测序表明 ,插入的基因片段为HpHspA和Mr 为 180 0 0OMP编码基因 ,由 891个碱基组成 ,与GenBank中登录的序列相比较 ,有 1.15 %的碱基发生变异 ,1.2 6 %的氨基酸残基改变。经SDS PAGE分析发现 ,融合基因表达的蛋白Mr 为 5 1× 10 3 ,其中 pET32a(+)表达的蛋白Mr 约为 2 0×10 3 ,可溶性表达产物占菌体总蛋白的 18.96 %。重组蛋白经Ni NTA琼脂糖树脂纯化后 ,其纯度达 95 %以上。用Westernblot分析显示 ,该重组蛋白可被Hp阳性患者的血清及抗Mr为 180 0
- 姜政黄爱龙蒲丹陶小红王丕龙
- 关键词：幽门螺杆菌热休克蛋白A外膜蛋白原核表达载体
- 共表达EGFP和UreB活载体疫苗的体内外稳定性研究被引量：2
- 2006年
- 建立共表达人幽门螺杆菌UreB和绿色荧光蛋白的重组耻垢分枝杆菌疫苗株,为进一步应用重组耻垢分枝杆菌疫苗防治幽门螺杆菌感染打下基础。利用聚合酶链反应(Polym erase chain reaction,PCR)扩增的幽门螺杆菌的尿素酶编码基因全长片段,克隆入大肠杆菌-分枝杆菌穿梭质粒pLA 73,构建pLA 73-UreB载体,将pLA 73-UreB和pEGFP共转化耻垢分枝杆菌,经卡那霉素和氨苄青霉素双筛选后,抽提质粒用PCR法鉴定,W esternb lot检测UreB的表达及活性。液体培养菌液在荧光显微镜下发出明亮的绿色荧光。从幽门螺杆菌基因组中扩增出约1 710 bp的基因片段,所构建重组体阳性克隆经酶切和PCR鉴定与预期结果一致,测序结果确证了插入片段的正确性,W estern b lot检测说明幽门螺杆菌的UreB编码基因在分枝杆菌中获得了表达并具有良好的免疫原性。成功构建了共表达EGFP和幽门螺杆菌UreB基因的耻垢分枝杆菌疫苗,为其在幽门螺杆菌的防治中的应用奠定了研究基础。
- 向廷秀谯敏姜政陶小红黄爱龙王丕龙
- 关键词：疫苗耻垢分枝杆菌
- 分枝杆菌穿梭表达质粒pJHSP70的构建及鉴定被引量：4
- 2008年
- 目的用结核分枝杆菌热休克蛋白70(heat shock protein70,HSP70)启动子改建分枝杆菌穿梭质粒pJEM11为分枝杆菌穿梭表达质粒pJHSP70,并对其功能进行鉴定。方法以卡介苗(BCG)基因组DNA为模板,利用聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增HSP70启动子,克隆至pMD18-T载体,经鉴定后,再定向克隆入pJEM11的ApaⅠ位点与SnaBⅠ位点之间,构建pJHSP70载体,并对载体进行PCR及酶切鉴定,然后再将幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,HP)尿素酶B亚单位(urease B subunit,UreB)基因克隆入pJHSP70载体,评价其在耻垢分枝杆菌(Mycobacteria smegmatis,M.smegmatis)mc2155中的表达情况。结果从BCG基因组中扩增出160bp的基因片段,所构建的穿梭质粒经酶切和PCR鉴定与预期结果一致。测序结果证实插入片段正确,UreB基因在M.smegmatis中成功表达。结论成功改建穿梭质粒pJEM11为穿梭表达质粒pJHSP70。
- 吕琳曹红丹王丕龙刘少宁王丽娟向廷秀
- 关键词：结核分枝杆菌热休克蛋白70启动子基因表达
- 采用卡介苗结核蜡酸合酶启动子构建分枝杆菌穿梭表达质粒
- 2010年
- 目的采用卡介苗(BCG)结核蜡酸合酶(Mycocerosic acid synthase,Mas)启动子,将分枝杆菌穿梭质粒pJEM11改建为分枝杆菌穿梭表达质粒。方法 PCR扩增BCG基因组中Mas启动子,定向克隆至质粒pJEM11的ApaⅠ与SnaBⅠ位点之间,构建分枝杆菌穿梭表达质粒pJMas。将幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)UreB基因克隆至pJMas质粒,转化耻垢分枝杆菌(Mycobacteria smegmatis,M.smegmatis)mc2155,SDS-PAGE检测重组UreB蛋白在M.smegmatis mc2155中的表达,Western blot分析其反应原性。结果克隆的Mas启动子序列与结核杆菌H37Rv株的Mas启动子序列(gi31619628)同源性达99%;重组穿梭表达质粒pJMas经PCR及双酶切鉴定证明构建正确;UreB基因在M.smegmatis mc2155中成功表达,表达的蛋白可与Hp阳性病人血清发生特异性反应。结论成功构建分枝杆菌穿梭表达质粒pJMas,为构建以耻垢分枝杆菌为载体的多价疫苗奠定了基础。
- 曾瀚庆吕琳梅浙川王丕龙娄世锋
- 关键词：启动子基因表达
- 人幽门螺杆菌尿素通道蛋白UreI基因穿梭质粒的构建及表达被引量：2
- 2009年
- 目的构建人幽门螺杆菌尿素通道蛋白UreI基因的大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达质粒,并在耻垢分枝杆菌中进行表达。方法PCR扩增幽门螺杆菌尿素通道蛋白UreI编码基因全长片段,克隆入pET32a(+)质粒,鉴定正确后,再亚克隆入大肠杆菌-分枝杆菌穿梭质粒pJHSP70,构建分枝杆菌穿梭表达质粒pJHSP70-UreI,转化耻垢分枝杆菌,诱导表达后,进行SDS-PAGE和Western blot检测。结果从幽门螺杆菌基因组中扩增出585bp的UreI基因片段。重组质粒pJHSP70-UreI经酶切和PCR鉴定,与预期结果一致。目的蛋白表达量约占菌体总蛋白的18.5%,且具有良好的反应原性。结论已成功构建了幽门螺杆菌尿素通道蛋白UreI基因大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达质粒,并在耻垢分枝杆菌中获得表达。
- 吕琳曹红丹曾瀚庆王丕龙王丽娟刘少宁向廷秀
- 关键词：幽门螺杆菌耻垢分枝杆菌
- 耻垢分枝杆菌疫苗经灌胃免疫在小鼠体内的分布与安全性研究被引量：2
- 2009年
- 目的探讨携带编码幽门螺杆菌UreB基因质粒(pLUB)的重组耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis,M.s)经灌胃免疫在小鼠体内的分布和安全性。方法将携带绿色荧光蛋白(GFP)基因质粒(pLUB)的重组耻垢分枝杆菌灌胃BALB/c小鼠后8周,处死小鼠,观察胃、心、肝、脾、肺和肾组织中荧光蛋白的分布,测定小鼠肌酐及ALT;处死小鼠,分离出肺、肾、肝并分别测定其重量及HE染色。结果在BALB/c小鼠胃、脾组织中均检测到绿色荧光蛋白的表达,其他组织及对照组未检测到绿色荧光;小鼠体质量、各脏器质量、各血清肌酐和ALT含量与对照组无差异(P>0.05)。结论携带GFP的重组耻垢分枝杆菌可在胃和脾组织分布,对小鼠无系统毒性作用。
- 徐永柱吕琳
- 关键词：安全性绿色荧光蛋白
- 表达人幽门螺杆菌外膜蛋白的穿梭质粒的构建及在耻垢分枝杆菌中的表达被引量：5
- 2006年
- 目的建立表达人幽门螺杆菌外膜蛋白重组耻垢分枝杆菌疫苗株,为进一步应用重组耻垢分枝杆菌疫苗防治幽门螺杆菌感染打下基础。方法利用聚合酶链反应(Polymerasechainreaction,PCR)扩增的幽门螺杆菌的外膜蛋白528编码基因全长片段,克隆入pET32a(+),鉴定无误后,再亚克隆入大肠杆菌-分枝杆菌穿梭质粒pLA71,构建pLA71-omp载体,将pLA71-omp电转化耻垢分枝杆菌,经卡那霉素筛选后,抽提质粒用PCR法鉴定,Westernblot检测omp的表达及活性。结果从幽门螺杆菌基因组中扩增出约528bp的基因片段。所构建重组体阳性克隆经酶切和PCR鉴定与预期结果一致,测序结果确证了插入片段的正确性,Westernblot检测说明幽门螺杆菌的外膜蛋白528编码基因在分枝杆菌中获得了表达并具有良好的免疫原性。结论成功构建了幽门螺杆菌外膜蛋白528编码基因大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达质粒。该质粒能在E.coli/MS间进行穿梭,并在耻垢分枝杆菌中表达。
- 向廷秀谯敏姜政陶小红黄爱龙王丕龙
- 关键词：幽门螺杆菌OMP耻垢分枝杆菌
- 表达幽门螺杆菌外膜蛋白的重组耻垢分枝杆菌疫苗菌对小鼠的免疫保护作用被引量：3
- 2007年
- 为研究含pLAO的重组耻垢分枝杆菌疫苗(Recombinant Mycobacterium smegmatis,rM.S)对小鼠的保护作用。将重组耻垢分枝杆菌疫苗pLAO(MS)2×107灌胃免疫接种BALB/c小鼠,同时设PBS组、耻垢分枝杆菌空菌组,免疫4周后,各组处死一批小鼠,取胃组织待用;余下的小鼠用幽门螺杆菌标准株(Helicobacter pylori SS1,Hp SS1)攻击2次,4周后处死小鼠,进行胃组织快速尿素酶试验、Hp培养、炎症程度及其炎症活动度评分,以评价疫苗对胃黏膜Hp感染的免疫保护作用,ELISA检测Hp特异性血清IgG和IgA水平。结果表明疫苗组Hp定植评分均明显低于PBS组和空菌组,疫苗组不仅可以降低Hp的定植,而且能减轻Hp造成的小鼠胃黏膜的局部慢性炎症反应。免疫后BALB/c小鼠特异性抗体显示rM.S疫苗诱导的Hp特异性血清IgG、IgA水平都升高。因此rM.S疫苗经灌胃接种BLAB/c小鼠能降低Hp定植,减轻胃黏膜的炎症反应,对Hp感染有明显的预防保护作用。
- 向廷秀谯敏姜政陶小红黄爱龙王丕龙
- 关键词：幽门螺杆菌
