国家自然科学基金(30371328)
- 作品数：15 被引量：22H指数：4
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- 病毒编码的miRNA:基因表达新的调控因子
- 2007年
- 微小RNA(microRNA,miRNA)是一类长约22个核苷酸的RNA,在数量、序列、结构、表达和功能上具有多样性。目前,通过生物信息学手段和分子克隆方法,已发现了3518种miRNA,在控制细胞的生长发育、分化、凋亡等过程中发挥着十分重要的作用。最近研究发现疱疹病毒、多瘤病毒、逆转录病毒的某些病毒基因组也能够编码miRNA,这些miRNA在调控病毒基因自身表达以及病毒与宿主相互作用方面可能起重要的作用。某些病毒甚至能够利用宿主体内的miRNA调控其自身表达。找出病毒可能编码的miRNA,探索其对病毒感染、复制、表达的作用,有助于病毒分子生物学的研究,也会为研发防治病毒的新方法和新途径提供新的思路。
- 戚鹏韩金祥鲁艳芹
- 关键词：MIRNA基因调控生物信息学CDNA克隆
- HDV核酶对乙型肝炎病毒抑制作用的研究
- 2007年
- 目的研究HDV核酶在细胞内对乙型肝炎病毒(HBV)复制及其抗原表达的抑制作用。方法1)以HBV前基因组mRNA为靶基因,体外筛选出HDV核酶有效作用位点,构建HDV核酶并进行体外测活;2)分别选用tRNA-Val、U6和hCMV 3种真核启动子,重组构建HDV核酶真核表达载体ptVHRz、pSURz和pcDHRz,分别用3种载体转染HepG2.2.15细胞;3)用点杂交、ELISA和实时荧光定量PCR方法分别检测核酶在细胞内的表达及对HBV的抑制作用。结果在HBV C基因区筛选到一位点,所构建的HDV核酶在体外条件下对该位点能产生有效切割。3种核酶表达载体在细胞内均能高效表达,在转染48 h后,ptVHRz和pcDHRz对HBeAg的表达产生了明显的抑制作用,而对HBsAg没有抑制作用。三者对HBV的复制均未产生明显影响。结论HDV核酶在细胞内对HBV抗原的表达能产生特异性抑制作用,但未能有效抑制HBV的复制,对其原因需进一步深入研究。
- 孟斌潘光锦刘毅鲁艳琴韩金祥温博贵
- 关键词：核酶基因疗法转染
- 逆转录病毒靶向介导HDV核酶体外抑制HBV表达被引量：4
- 2007年
- 目的包装携带HDV核酶的肝细胞靶向性逆转录病毒载体,并检测体外HDV核酶对乙型肝炎病毒表达的影响。方法采用脂质体法,分别包装出携带针对HBV不同基因组区域的HDV核酶的肝细胞靶向性重组逆转录病毒,感染HepG2215细胞,ELISA及荧光定量PCR检测HDV核酶对乙型肝炎病毒表达的抑制作用。结果pMSCV-U6-PreS2-Rz和pM-SCV-U6-C-Rz对乙型肝炎病毒表面抗原抑制率明显高于其他HDV核酶和对照组,分别达80%和85%,且高于脂质体转染介导的同种核酶对乙型肝炎病毒表面抗原表达的抑制率。结论靶向性重组逆转录病毒能够携带HDV核酶进入HepG2215细胞,并且对乙型肝炎病毒的表达有较高的抑制作用,为抗病毒治疗的研究奠定了基础。
- 戚鹏韩金祥鲁艳芹王传玺
- 关键词：HDV核酶乙型肝炎病毒
- 抗乙型肝炎病毒HDV核酶的研究新进展
- 2005年
- 乙型肝炎病毒 (HBV)是严重威胁人类健康的一种病毒 ,特别是在我国约有 1 2亿人为HBV携带者 ,占世界的 1 3。对已感染HBV者 ,常用的化学及免疫疗法通常无效。今年来 ,研究者试图利用反义技术 ,通过在基因表达水平上抑制HBV的复制 ,来达到治疗HBV感染的目的。核酶是具有RNA裂解活性的RNA分子 ,能特异地结合并切割靶RNA分子。HDV核酶是唯一在人体细胞天然具有裂解活性的核酶类型 ,研究将HDV核酶作为HBV的反义抑制剂可能有着其独特的优势。本文就HDV核酶靶位点的筛选、病毒载体导入系统、靶向性分子的构建等热点问题的研究新进展予以综述。
- 王传玺韩金祥鲁艳芹
- 关键词：HDV核酶HBV携带者抗乙型肝炎病毒RNA分子靶位点基因表达水平
- 细胞实验中细胞生长及换液处理对实验结果的影响
- 2005年
- 利用所设计的核酶抑制转染了HBV的HEPG2细胞内病毒的复制,对所产生的病毒抗原的量进行统计学处理,从而观察到细胞生长和细胞培养液换液对结果的影响。结果表明,换液处理组与未换液处理组的抑制率不同;在96h,未经换液的孔抑制率出现了负值。细胞在80h后数目减少,镜检显示细胞状态不佳。应用细胞生长曲线和细胞换液处理对于实验结果有一定的修正作用。
- 栾中华韩金祥鲁艳芹
- 关键词：细胞转染HEPG2细胞酶联免疫吸附
- 靶向肝细胞重组逆转录病毒载体的构建
- 2007年
- 目的:包装5种携带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的重组逆转录病毒,筛选肝细胞靶向性好的病毒载体。方法:在前期构建的融合表达质粒基础上,构建4种新的表达质粒,采用脂质体法将这5种质粒分别与质粒pL-EGFP共转染已稳定表达Gag-Pol蛋白的NIH3T3包装细胞系中,48 h后收获病毒上清,分别感染肝源性HepG2215细胞及非肝源性293T细胞,48 h后提取细胞总RNA,荧光定量PCR比较重组病毒的靶向性。结果:酶切鉴定结果表明4种新的表达质粒构建成功,包装的病毒滴度约为105cfu/ml,以pcDNA3.1(-)-envm-preS1-S2质粒包装的病毒有较好的肝细胞靶向性。结论:包装的肝细胞靶向性好的重组逆转录病毒载体,为包装携带HDV核酶的病毒载体以及HDV核酶抑制乙型肝炎病毒复制表达的研究奠定了基础。
- 戚鹏韩金祥鲁艳芹王传玺
- 关键词：肝细胞逆转录病毒科DNA突变分析聚合酶链反应
- MoMLVgag-pol基因在NIH3T3细胞中的表达和鉴定被引量：3
- 2006年
- 目的:构建含MoMLVgag-pol基因的重组表达载体,实现其在NIH3T3细胞中稳定表达。方法:应用RT-PCR方法反转录并扩增gag-pol基因,克隆入真核表达载体pcDNA4/HisMaxA上,构建重组表达载体pcDNA4/HisMaxA-gag-pol,用脂质体法转染NIH3T3细胞,Zeocin筛选稳定表达细胞株,通过SDS-PAGE分析检测表明,gag-pol基因在NIH3T3细胞实现了表达,产物相对分子质量(kDa)为194.78×103。然后,将逆转录病毒载体导入此细胞系,包装逆转录病毒。用PCR与标记基因补救分析法检测野生型辅助病毒。结果:酶切鉴定的片段大小分别为5.2kb,与预期大小一致,经Zeocin筛选后获得稳定表达细胞株,SDS-PAGE实验表明产物融合蛋白相对分子质量(kDa)为194.78×103,与预期相符。脂质体转染包装细胞,嘌呤霉素加压筛选出高病毒滴度(4.0×106CFU/ml)的细胞克隆,且未检测到辅助病毒。结论:构建的融合表达载体pcDNA4/HisMaxA-gag-pol及其在NIH3T3细胞中的表达,构建成功具有靶向性的逆转录病毒包装细胞系,该细胞系能够包装出高滴度的逆转录病毒,为肝细胞的基因治疗提供了一种新的基因转移系统。
- 王传玺韩金祥鲁艳芹宋宝刘杰
- 关键词：MOMLVNIH3T3细胞真核表达载体
- 乙型肝炎病毒前S2-ENV融合基因在NIH3T3细胞中的表达和初步鉴定
- 2007年
- HBV是严重威胁人类健康的病毒之一，在我国约有1．2亿HBV携带者，但目前对乙型肝炎的治疗仍停留在对症治疗及调节机体免疫功能等阶段，尚无直接抑制HBV复制的有效方法。反义技术是依赖反义寡核苷酸（ODN）、反义RNA和核酶（ribozyme）等手段进行基因治疗、基因调控研究的方法。它在基因水平上考虑选择性关闭或修饰靶基因，使其失活而达到对疾病的特异性治疗，或研究特定基因功能及基因调控机制等。HBV在复制过程中经历了从前基因组mRNA逆转录到DNA的过程，利用反义技术能直接抑制病毒复制。
- 王传玺韩金祥鲁艳芹宋宝高雪芹
- 关键词：乙型肝炎病毒NIH3T3细胞融合基因HBV携带者基因调控机制
- 核酶抑制乙型肝炎病毒的研究进展
- 2005年
- 核酶是一种有自动切割作用的RNA分子,不仅能够与双链DNA或者是RNA分子结合从而抑制他们的转录或翻译,而且由于它的自动切割作用能够在相应的位点切割核酸序列,具有酶的活性,因而其在HBV的基因治疗中的前景比较看好。本文针对乙型病毒性肝炎核酶的设计、构建、靶向性导入和稳定表达等问题进行了综述。
- 栾中华韩金祥鲁艳芹
- 关键词：核酶靶向性HBV基因治疗
- HBV靶向性HDV核酶载体的筛选被引量：4
- 2005年
- 目的探讨利用核酶(ribozyme)独特的切割抑制活性,抑制乙型肝炎病毒的复制生长,可以用来治疗乙型病毒性肝炎。利用各种方法筛选出HBV靶向性HDV核酶载体。方法根据山东省医药生物技术研究中心构建的HDV核酶结构特点,筛选并合成核酶序列,构建到原核载体中,转染到细胞中,根据测定载体的抑制效果,从而筛选出效果好的核酶载体。结果通过ELISA检测和定量PCR检测筛选出了2种抑制效率高的HDV核酶,抑制率达68%。结论应用ELISA检测和定量RT-PCR检测联合的方法可以筛选出比较符合细胞内条件的核酶,以便后续实验。
- 栾中华韩金祥鲁艳芹王传玺裴晓俊
- 关键词：核酶丁型肝炎病毒基因治疗
