国家自然科学基金(30371320)
- 作品数：4 被引量：19H指数：2
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- 增强型绿色荧光蛋白真核表达载体的构建和表达被引量：14
- 2005年
- 目的 构建增强型绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescent protein, EGFP)编码基因的真核表达载体 pcDNA3.1(+) GFP,并观察其在Hep 2细胞中的表达情况。 方法 据已知的EGFP基因序列,设计合成 1 对引物,并引入Hind Ⅲ和EcoR Ⅴ酶切位点。应用PCR技术,从含有 EGFP的 pAdTrack CMV中扩增 EGFP编码基因。通过 TA连接将其克隆入pGEM T easy载体,经PCR及限制性内切酶鉴定后,插入真核表达质粒pcDNA3.1(+)中,转化Esche richia coli DH5α感受态细胞,于Amp+ LB平板上筛选阳性克隆。重组子经 Hind Ⅲ和EcoRⅤ双酶切、PCR鉴定,将该载体转染人喉癌细胞 Hep 2 后 48 h观察 EGFP表达情况。 结果 成功构建了含 EGFP 编码基因的真核表达载体pcDNA3.1(+) GFP,并成功转染Hep 2细胞,在倒置荧光显微镜下呈现绿色光。 结论 获得可产生绿色荧光的 EG FP,能方便地用作报告基因和筛选标记。
- 李小月何金生沈继龙宋蔚汪学龙胡元生
- 关键词：绿色荧光蛋白真核表达
- A亚型人呼吸道合胞病毒G基因的克隆、真核表达被引量：2
- 2006年
- 目的克隆A亚型人呼吸道合胞病毒(HRSV)G基因,构建G基因的真核表达载体,并进行表达和鉴定。方法自行设计引物,利用RTPCR技术,从感染HRSV的HEp2细胞中获得G基因片段,克隆到pGEMTeasy载体,经核酸序列分析,进一步亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+),酶切鉴定后,脂质体法转染COS7细胞,RTPCR和Westernblotting鉴定基因转录和蛋白表达。结果真核表达载体pcDNA3.1(+)G的限制性内切酶分析结果与预期一致,基因序列分析显示没有发生无义突变。转染COS7细胞后,RTPCR检测到G基因有转录,Westernblotting分析观察到G蛋白特异性的表达条带。结论成功克隆A亚型HRSVG基因,并在真核细胞中获得表达。
- 李栋梁宋蔚汪红俊李群黄保军胡春松罗畅民何金生
- 关键词：呼吸道合胞体病毒
- 乙型肝炎病毒表面抗原基因的克隆及序列分析
- 2004年
- 目的克隆并鉴定乙型肝炎病毒表面抗原基因,为下一步构建该重组腺病毒载体以及进一步研究腺病毒载体的包装及在乙型肝炎病毒基因治疗中的作用。方法参照人 HBV adr 亚型序列,设计和合成 S 基因特异引物。应用 PCR 技术,从含有 HBsAg 的 HBV DNA 中扩增目的 DNA,通过 TA 连接将其克隆人 pGEM-T easy 载体,经限制性内切酶 BglⅡ/SalⅠ鉴定后,进一步测序鉴定。结果从乙肝表面抗原阳性(HBsAg+)血清中成功提取 HBV DNA,并以此 DNA 为模板,成功扩增出 S 基因,测序结果与 GenBank 中注册的相应序列比对,核苷酸序列的同源性高达92％～99％,预测氨基酸序列同源性亦达82％。结论从 HBsAg 阳性血清中成功克隆出 S 基因序列,为进一步构建重组腺病毒及后续实验奠定了基础。
- 李小月何金生沈继龙汪学龙姜山
- 关键词：乙型肝炎病毒乙肝表面抗原阳性重组腺病毒载体ADR亚型序列同源性S基因序列
- 重组腺病毒方法的改建被引量：3
- 2005年
- 目的对构建重组腺病毒的AdEasy载体系统的操作过程予以改进,使其更加简便、高效。方法将腺病毒骨架载体pAdEasy-1用电穿孔法转化大肠埃希菌BJ5183,获得含pAdEasy-1的大肠埃希菌BJ5183/p菌株。氯化钙法制备大肠埃希菌BJ5183/p感受态细胞,并转化含绿色荧光蛋白的穿梭载体,通过同源重组获得重组腺病毒质粒。以限制性内切酶PacⅠ酶切,得到重组腺病毒DNA分子,转染293细胞。结果293细胞出现细胞病变,荧光显微镜观察有绿色荧光。结论成功获得一种以AdEasy系统为基础的简便、高效构建重组腺病毒的新方法。
- 张梅何金生朱梅汪红俊
- 关键词：重组腺病毒绿色荧光蛋白
