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天然人源IgG Fab噬菌体抗体库的构建及多样性分析被引量：4: 2010年; 目的:构建天然人源IgGFab噬菌体抗体库并分析来源于健康人外周血B淋巴细胞的抗体基因可变区的多样性及优势选择。方法:以DNA重组技术从300名健康志愿者的外周血淋巴细胞中扩增出全套人抗体轻链及重链Fd基因,分别插入噬菌体载体pFabICN相应位置,构建天然人源免疫球蛋白G基因文库;进一步从抗体库中随机挑选克隆,获得重轻链基因进行核苷酸序列测定并利用IgBLAST数据库分析抗体基因可变区的同源家族。结果:从4×108库容的天然人源IgGFab噬菌体抗体库中随机挑选克隆,对其中32个轻链及重链Fd基因插入正确的克隆进行核苷酸序列测定和氨基酸序列的推算,获得29条彼此完全不同的Fd重链基因及轻链基因。以IgBLAST数据库比对分析显示29条重链基因的V区分别属于VH3(72.4%),VH1(10.3%),VH4(6.9%),VH5(6.9%)和VH7(3.4%)基因家族。29条轻链基因分别属于Vκ1(44.8%),Vκ2(15.4%),Vκ3(11.5%),Vκ4(23.1%)基因家族和Vλ1(11.5%)基因家族。结论:以300份健康人外周血淋巴细胞的抗体基因构建的天然人源IgGFab噬菌体抗体库基因多样性良好,重链VH3基因家族存在优势表达。; 邵红霞章黎杨彬冯萌付永峰Hiroshi Tachibana程训佳; 关键词：免疫球蛋白重链基因

大容量人免疫球蛋白G基因文库的构建及初步应用: 2009年; 目的从大容量人免疫球蛋白G基因文库中获得尘螨2类变应原特异的IgG Fab片段。方法通过DNA重组技术,从300名健康志愿者的外周血淋巴细胞中扩增全套人抗体轻链及重链Fd基因,分别插入pFab1-His2相应位置,构建人免疫球蛋白G基因文库;以重组粉尘螨2类变应原(rDer f2)作为抗原,采用克隆印迹法对抗体库进行筛选,ELISA验证以获得阳性克隆;提取阳性克隆质粒,进行核苷酸序列测定并推算氨基酸序列,Kabat数据库分析轻、重链基因的同源性,表面等离子共振BIAcore检测纯化的Fab片段与rDer f2的亲和力。结果从9×108库容的人免疫球蛋白G基因文库中筛选1.28×106个克隆,获得2个可与尘螨变应原特异结合的阳性克隆AM1和AM2。序列比较显示2个克隆的重链完全同源;同源性分析显示,AM1、AM2轻链可变区近似系分别为K2-30和K1-12,重链可变区近似系为VH3-30;BIAcore检测显示,2个克隆的Fab片段与rDer f2的结合常数分别为6.1×107和5.7×107,解离常数分别为3.1×10-8和4.1×10-8。结论从未经免疫的大容量人免疫球蛋白G基因文库获得具有较高亲和力的尘螨变应原特异的IgG Fab片段。; 邵红霞付永锋Hiroshi Tachibana程训佳; 关键词：尘螨变应原变应性哮喘

上海地区户尘螨的分离培养及Der p 2基因的克隆与表达被引量：3: 2006年; 克隆化培养上海地区户尘螨,获得不同编码序列的重组Der p 2变应原进行当地人群血清特异性IgG分析,探讨其应用价值。从过敏性疾病患者床褥采集分离户尘螨,采用封闭式培养系统进行培养,分离培养单个孕螨获得克隆化的螨群。用RT-PCR的方法扩增不同螨克隆的Der p 2编码基因,插入原核表达载体pET-19b在大肠杆菌内进行表达,所获得的蛋白经Dot blot和ELISA检测其抗原性及与人群血清IgG的反应水平。结果显示,成功对户尘螨种群进行克隆化培养。获得14个核苷酸多样性位点,对应的两个不同序列的重组Der p 2蛋白与鼠单抗1D8的亲和力不同,但与上海地区人群IgG结合力相似(r=0.864)。检测不同地区尘螨主要变应原的序列多样性,有助于开发更有针对性的疫苗组分,以及特异性保护性IgG的筛选。; 范怡敏杨彬邵红霞庄义军程训佳; 关键词：户尘螨克隆化培养 P

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国家自然科学基金(30371331)