福建省自然科学基金(2009J01181)
- 作品数：2 被引量：1H指数：1
- 相关作者：黄俏佳董荔红兰风华钱凤英韩俊勇更多>>
- 相关机构：南京军区福州总医院更多>>
- 发文基金：南京军区医药卫生科研基金福建省自然科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- MEKK2基因siRNA重组腺病毒表达载体的构建及其对MEKK2的表达抑制被引量：1
- 2012年
- 设计并合成针对人MEKK2基因3个不同部位siRNA靶点的模板DNA序列,将合成的互补片段退火后克隆入pRNAT-H1.1/Adeno穿梭载体中,并使其在大肠杆菌BJ5183中与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1进行同源重组。将经鉴定正确的重组腺病毒质粒转染293A细胞,包装得到具有感染能力的pAd-MEKK2-siRNA重组腺病毒。病毒体外转导人胃腺癌AGS细胞,Western blot印迹法检测其对MEKK2表达的抑制。经酶切和测序鉴定均证实pAd-MEKK2-siRNA重组腺病毒载体构建成功,其插入序列正确无误。Western blot印迹检测结果显示,重组腺病毒表达载体可抑制MEKK2基因的表达,以pAd-MEKK2-siRNA2(针对MEKK2 cDNA 992-1 010的片段)抑制效果为最佳,pAd-MEKK2-siRNA1(针对MEKK2 cDNA 1 456-1 474的片段)和pAd-MEKK2-siRNA3(针对MEKK2 cDNA 1 351-1 369的片段)则未见明显的抑制效果。DNA Ladder和细胞存活测定结果表明,敲减MEKK2的表达后,AGS细胞接受H2O2刺激后的凋亡受到较强抑制、细胞存活数增加,明显高于野生型细胞和转导siRNA阴性对照腺病毒细胞接受H2O2刺激后的,差异具有统计学意义(P<0.05),而后两者之间差异无统计学意义(P>0.05)。该研究成功地构建了针对MEKK2基因的siRNA重组腺病毒载体,为进一步深入研究MEKK2基因在人胃腺癌细胞中的作用和功能奠定了基础。
- 钱凤英兰风华董荔红黄俏佳
- 关键词：腺病毒载体RNA干扰H2O2细胞凋亡
- AKT2基因的过表达抑制H_2O_2诱导的乳腺癌细胞凋亡
- 2011年
- 研究AKT2基因对H2O2诱导的乳腺癌细胞凋亡的影响.RT-PCR扩增人AKT2基因全长cDNA序列后克隆入pcDNA3.1/myc-His(-)A质粒中,构建AKT2基因的真核表达载体(野生型,WT-AKT2);应用QuikChange定点诱变,制备AKT2激酶活性丧失的负性表达载体(DN-AKT2).WT-AKT2和DN-AKT2分别转染人乳腺癌MCF-7细胞,新霉素筛选稳定转染细胞克隆;设计并合成针对人AKT2基因2个不同部位的siRNA片段,转染入同样的细胞.通过TUNEL和DNA ladder测定,研究转染AKT2基因及AKT2 siRNA前后细胞对H2O2诱导凋亡的抵抗作用.测序鉴定证实,WT-AKT2和DN-AKT2表达载体构建成功.Western印迹结果显示,WT-AKT2和DN-AKT2基因在MCF-7细胞中表达良好,而AKT2 siRNA则可有效地抑制AKT2的表达;TUNEL和DNA ladder测定结果表明,WT-AKT2表达上调的稳定克隆组,可显著提高MCF-7细胞对H2O2诱导的凋亡的抵抗作用(转染DN-AKT2具相反作用).经H2O2作用后,其凋亡细胞数显著低于空载体稳定转染克隆及未转染亲代细胞的,差异具有统计学意义(P<0.05),而后两者之间差异无统计学意义(P>0.05).AKT2抑制乳腺癌细胞对H2O2诱导凋亡的作用可被AKT2 siRNA和PI3K/AKT信号途径抑制剂wortmannin所阻断.内源性的结果进一步证明了AKT2的功能.本研究表明,AKT2能够抑制H2O2诱导的MCF-7人乳腺癌细胞凋亡,可能成为乳腺癌治疗的靶点之一,并为研究乳腺癌细胞抵抗活性氧诱导的细胞凋亡的分子机制奠定了基础.
- 凌彩虹兰风华韩俊勇董荔红黄俏佳
- 关键词：RNA干扰基因转染H2O2细胞凋亡
