国家自然科学基金(30960404)
- 作品数：12 被引量：25H指数：3
- 相关作者：王琪李力张玮李状阳志军更多>>
- 相关机构：广西医科大学附属肿瘤医院重庆三峡中心医院广西医科大学更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金广西壮族自治区科学研究与技术开发计划国家高技术研究发展计划更多>>
- 相关领域：医药卫生更多>>
- 卵巢恶性肿瘤组织叶酸结合蛋白表达检测及其临床意义被引量：3
- 2012年
- 背景与目的:叶酸结合蛋白(folate binding protein,FOLR1)又称为叶酸受体蛋白,对细胞分裂、增殖和生长有着非常重要的作用。FOLR1在正常组织中表达较低,但在卵巢癌中存在过度表达。本研究探讨卵巢恶性肿瘤组织中FOLR1的表达及其临床意义。方法:采用Western blot检测80例卵巢恶性肿瘤组织、50例卵巢良性肿瘤组织及30例正常卵巢组织中的FOLR1表达情况,分析其与卵巢恶性肿瘤临床病理及多药耐药的相关性。结果:FOLR1在正常卵巢组织、卵巢良性肿瘤组织和卵巢恶性肿瘤组织中的表达量依次增高(P<0.01)。FOLR1在卵巢恶性肿瘤临床分期中Ⅰ～Ⅱ期的表达量低于Ⅲ～Ⅳ期(P<0.05)。FOLR1在铂类药物耐药型卵巢恶性肿瘤中的表达量低于铂类药物敏感型(P<0.01);治疗后肿瘤进展者的表达量低于缓解者(P<0.01)。FOLR1在黏液性肿瘤中的表达量低于浆液性肿瘤(P<0.05),恶性卵巢肿瘤有淋巴结和远处器官转移的高于无转移者(P<0.05),其表达量与患者的不同肿瘤病理分类、是否有大网膜转移和腹水量无明显相关(P>0.05)。取FOLR1表达量界值为3.115时来判断卵巢肿瘤性质,ROC曲线的Youden指数最大,卵巢恶性肿瘤FOLR1表达量的高低与中位生存时间长短差异无明显相关(P>0.05),Cox模型多因素分析显示,FOLR1表达量不是影响患者生存预后的独立因素。结论:FOLR1可作为一种新型的卵巢恶性肿瘤早期诊断标志物,并可成为判断卵巢恶性肿瘤多药耐药潜在标志之一。
- 黄明钜王琪张玮尹巧云李状李力
- 关键词：卵巢恶性肿瘤耐药
- 携带人二氢叶酸还原酶基因慢病毒表达载体构建及鉴定
- 2012年
- 目的:构建携带人二氢叶酸还原酶(DHFR)基因的慢病毒表达载体pWPI。方法:采用PCR方法扩增二氢叶酸还原酶cDNA全长,与EZ-T克隆载体连接,HindIII及BamHI-HF限制性内切酶双酶切回收的PCR片段并补平其缺口。慢病毒系统载体使用pWPI系统,采用PmeI酶切载体后回收片段,将其磷酸化,T4酶连接载体与目的基因。表达载体鉴定均采用核苷酸序列测定,重组质粒采用脂质体转染293T包装细胞后获得包装的病毒颗粒。结果:成功扩增二氢叶酸还原酶全长并连接入pWPI载体构建成重组表达载体DHFR-pWPI,重组质粒测序结果显与DHFR基因的同源性达100%,按标准生产程序转染293T后有DHFR基因的表达。结论:成功采用慢病毒载体系统构建了二氢叶酸还原酶重组慢病毒转基因,为探讨DHFR在肿瘤多药耐药过程中的分子机理奠定基础。
- 李状王琪张玮阳志军黄明钜李力
- 关键词：DHFR293T细胞
- 沉默二氢叶酸还原酶基因对卵巢癌细胞体外生物学行为的影响被引量：3
- 2016年
- 背景与目的:二氢叶酸还原酶(dihydrofolate reductase,DHFR)在卵巢上皮癌铂类耐药细胞中高表达。该研究旨在探讨DHFR基因沉默对卵巢癌细胞体外生物学行为的影响,为卵巢癌铂类耐药的治疗奠定基础。方法:设计DHFR基因靶向的发夹状si RNA,筛选出最佳si RNA沉默片段,构建携带有目的基因的慢病毒载体细胞即转染组(DHFR-p GCSIL-SKOV3细胞)及阴性对照组细胞(p GCSIL-SKOV3细胞)。采用流式细胞仪检测3组细胞在不同的顺铂质量浓度(2.5、5.0、10.0和20.0μg/m L)下不同时间段(24、48及72 h)的凋亡情况以及IC_50顺铂质量浓度(4.4μg/m L)的周期变化;采用高效液相色谱法检测不同顺铂质量浓度(2.5、5.0和7.5μg/m L)不同时间段(24和48 h)药物作用后3组细胞内的顺铂浓度。采用透射电镜观察IC_50顺铂质量浓度(4.4μg/m L)3种细胞的超微结构变化。结果:将退火后的双链寡核苷酸片段连接到p GCSIL/GFP载体,测序结果正确。转染SKOV3细胞后,蛋白[质]印迹法(Western blot)鉴定干扰效果。在给药24、48和72 h后,DHFR-p GCSIL-SKOV3、p GCSIL-SKOV3及SKOV3三组细胞的凋亡率随着顺铂质量浓度(2.5、5.0、10.0和20.0μg/m L)的上升而升高,DHFR-p GCSIL-SKOV3细胞给药48和72 h后的凋亡率明显高于p GCSIL-SKOV3及SKOV3细胞,差异有统计学意义(P<0.05)。3组细胞在IC_50顺铂质量浓度(4.4μg/m L)给药24和48 h后,转染组G_0/G_1期细胞比例较阴性及空白对照组明显增多,G_2/M、S期则反之;而给药72 h后,3组细胞以G_2/M及S期为主,转染组低于阴性及空白对照组。采用高效液相法检测细胞内顺铂质量浓度时,转染组在2.5和5.0μg/m L顺铂质量浓度给药24和48 h后,其细胞内顺铂浓度均明显高于对照组。转染组在7.5μg/m L顺铂质量浓度给药24 h后,其细胞内顺铂浓度均明显低于对照组细胞,在48 h后却又高于对照组,差异有统计学意义(P=0.034,P=0.014)。未给药时,转染组细胞的微丝明显多于
- 李状张玮王琪阳志军李力
- 关键词：二氢叶酸还原酶透射电子显微术
- 下调MTRR基因表达对顺铂耐药的卵巢上皮性癌细胞自噬和凋亡的影响及机制研究被引量：5
- 2016年
- 目的探讨下调甲硫氨酸合成酶还原酶（MTRR）基因表达对顺铂耐药的卵巢上皮性癌（卵巢癌）细胞自噬和凋亡的影响及作用机制。方法（1）实验分为3组：下调MTRR基因表达的SKOV3/DDP细胞（SKOV3／DDP-MTRRi组）、转染阴性对照（NC）序列的SKOV3／DDP细胞（SKOV3／DDP．NC组，作为阴性对照）、未转染的SKOV3／DDP细胞（SKOV3／DDP组，作为空白对照）。不同浓度（0、1、2、4μg/ml）顺铂作用后，采用流式细胞仪检测3组细胞的凋亡率，免疫荧光法检测3组细胞的自噬现象，蛋白印迹（westernblot）法检测3组细胞中自噬标志分子自噬微管相关蛋白轻链3B（LC3B）、p62蛋白的表达，透射电镜观察3组细胞中自噬体的形成情况。（2）雷帕霉素诱导后SKOV3／DDP．MTRRi细胞自噬及凋亡情况变化的检测，实验分为4组，雷帕霉素组（5nmol/L雷帕霉素处理）、雷帕霉素＋顺铂组（5nmol/L雷帕霉素＋4肛咖l顺铂处理）、顺铂组（4μg/ml顺铂处理）、空白对照组，采用westernblot法检测4组细胞中自噬标志分子LC3B、p62蛋白的表达，四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法检测4组细胞的生存率，流式细胞仪检测g组细胞的凋亡率。（3）4μg／ml．铂作用48h后，westernblot法检测3组（即SKOV3／DDP-MTRRi组、SKOV3／DDP-NC组、SKOV3／DDP组）细胞中凋亡相关因子半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（caspase）和Bcl-2家族以及磷脂酰肌醇3激酶（P13K），蛋白激酶B（Akt）自噬通路关键蛋白的表达。结果（1）不同浓度（0、1、2．4μg／ml）]顺铂组作用48h后，随着顺铂浓度的增加，3组细胞的凋亡逐渐增加，当顺铂浓度达到2μg／ml时，SKOV3／DDP．MTRRi组细胞的凋亡率[（26．2±1．4）％]明显高于SKOV3／DDP－NC组和SKOV3／DDP组[分别为（14．8±2．4）％、（14．2±214）％；P〈0．05]；免疫荧光法检测显示，随着顺铂浓度增加，SKOV3／DDP－MTRRi组细胞中LC
- 陈佳王琪张玮李力
- 关键词：多药顺铂自噬细胞凋亡
- FOLR1慢病毒表达载体的构建及鉴定被引量：1
- 2013年
- 本研究通过构建叶酸结合蛋白1(FOLR1)基因的慢病毒表达载体并进行表达鉴定。采用PCR技术扩增出基因全长,克隆至pWPI载体质粒,重组阳性克隆行PCR和测序鉴定,将重组载体质粒与辅助质粒共同转染人肾上皮(293T)细胞包装病毒,病毒颗粒感染人卵巢上皮癌(SKOV3)细胞,流式分选,RT-PCR和Western blot检测病毒感染后细胞中的FOLR1基因和蛋白表达。经鉴定结果显示重组载体质粒构建成功,293T细胞高效包装此慢病毒,携带FOLR1基因的慢病毒感染SKOV3细胞后可见大量绿色荧光细胞,流式分选后经两种方法分别检测出FOLR1基因和蛋白稳定表达。这为探讨FOLR1基因在卵巢恶性肿瘤中的生物学功能提供了实验基础。
- 黄明钜王琪张玮尹巧云李状李力
- 关键词：慢病毒表达载体卵巢癌
- 紫杉醇诱导的卵巢癌耐药基因表达谱与信号通路分析被引量：2
- 2011年
- 目的:探讨卵巢癌细胞对紫杉醇的耐药分子机制。方法:取对数生长期细胞按Trizol一步法抽提细胞总RNA,应用人类全基因组基因芯片检测卵巢癌耐药细胞株SKOV3/TS与敏感细胞株SKOV3细胞基因表达谱的变化,GOTermMapper软件鉴定差异基因功能,进一步利用IPA软件分析基因通路网络,筛查获得性紫杉醇卵巢癌耐药的相关基因。结果:紫杉醇诱导的卵巢癌耐药差异表达基因分别与细胞生长增殖,细胞合成和装配,细胞死亡,细胞周期调控和细胞信号传导相关。涉及DNA修复功能,DNA复制和细胞周期阻滞的基因主要是过度表达,而在代谢相关基因(特别是脂质代谢),信号传导,免疫和炎症反应,运输,转录调控和蛋白质的合成则是抑制表达。网络分析结果表明微管蛋白网络和以BAX为节点的细胞凋亡信号转导通路被促进。结论:紫杉醇耐药主要是与细胞合成与装备(包括许多微管蛋白基因诱导相关的基因和通路),脂质代谢、细胞粘附和细胞凋亡相关。BAX蛋白从微管蛋白释放被抑制可能是诱导卵巢癌细胞耐药的重要原因。
- 王琪尹茳平王鹤唐勇张玮李力
- 关键词：耐药细胞系基因表达谱紫杉醇卵巢癌
- 顺铂对FOLR1基因表达上调的卵巢上皮性癌细胞生物学功能的影响被引量：5
- 2013年
- 目的探讨顺铂作用于叶酸结合蛋白（FOLRl）基因表达上调的卵巢上皮性癌（卵巢癌）细胞系SKOV3细胞后对其生物学功能的影响。方法将FOLRl基因与pWPI质粒进行慢病毒包装，构建重组质粒pWPI—FOLRl并转染人SKOV3后得到pWPI—FOLR1-SKOV3细胞，作为重组质粒转染组；以同样方法将pWPI质粒转染入SKOV3后得到pWPI—SKOV3细胞，作为空载体转染组；并设立未转染的SKOV3细胞为空白对照组，采用逆转录（RT）一PCR技术和蛋白印迹法分别检测3组细胞中FOLRlmRNA和蛋白的表达。采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法，检测并绘制3组细胞的生长曲线，检测3组细胞对JJl^13的敏感性[以50％抑制浓度（IC50）表示，选择重组质粒转染组的IC50作为下一步实验中顺铂浓度的基准]，并检测不同浓度（分别为0．5×IC。1×IC。2×IC。即分别为1．8、3．6、7．2μg/ml；下同）顺铂作用不同时间（分别为24、48、72h，下同）后3组细胞生长的抑制率；采用流式细胞仪检测不同浓度顺铂作用不同时间后3组细胞的凋亡率，及不同浓度顺铂作用48h后3组细胞的细胞周期比例；高效液相色谱法检测同一浓度（3．6μg/ml）顺铂作用48h后3组细胞内N$t3的浓度。结果RT—PCR技术和蛋白印迹法分别检测显示，重组质粒转染组细胞中有FOLRlmRNA和蛋白的表达，而空载体转染组、空白对照组细胞中无FOLRlmRNA和蛋白的表达。MTT比色法检测显示，重组质粒转染组细胞生长速度最快、对顺铂最敏感（其IC50最低，为3．6μg／ml）、相同作用条件（包括顺铂的浓度和作用时间）下其细胞生长的抑制率最高，分别与空载体转染组、空白对照组比较，差异均有统计学意义（P〈0．05）；而空载体转染组与空白对照组比较，差异无统计学意义（P〉0．05）。流式细胞仪检测显示，3组细胞的凋亡率随着顺铂浓度（分别为1．8、3．6、7．2肛
- 黄明钜张玮王琪蔡祖艾李力
- 关键词：卵巢肿瘤顺铂
- 二氢叶酸还原酶基因表达上调对卵巢上皮性癌细胞顺铂耐药的影响
- 2015年
- 目的探讨二氢叶酸还原酶（DHFR）基因表达上调对卵巢上皮性癌（卵巢癌）细胞顺铂耐药的影响。方法构建携带DHFR基因的重组慢病毒载体（即重组载体DHFR—pWPI），利用脂质体lipofectamine2000将其转染至卵巢癌细胞系SKOV3细胞中。实验分为3组：转染组（转染重组载体DHFR-pWPI质粒）、阴性对照组（转染慢病毒载体pWPI质粒）、空白对照组（未转染任何质粒）。（1）蛋白印迹（western blot）法检测3组SKOV3细胞中DHFR蛋白的表达；（2）流式细胞仪检测3组SKOV3细胞经不同浓度（2．5、5．0、10．0、20．0μg／ml）顺铂作用不同时间（24、48、72h）后的细胞凋亡率，以及经3组细胞各自的50％抑制浓度（IC50;分别为6．0、4．0、4．9μg／ml，下同）的顺铂作用不同时间（24、48、72h）后的细胞周期比例；（3）高效液相色谱法检测3组SKOV3细胞经不同浓度（4．0、6．0、8．0μg/ml）顺铂作用不同时间（24、48h）后其细胞内顺铂浓度的变化；（4）透射电镜观察3组SKOV3细胞经各自的IC，。的顺铂作用不同时间（24、48、72h）后细胞超微结构的变化。结果本研究成功构建携带DHFR基因的重组载体DHFR—pWPI并转染入SKOV3细胞。（1）westernblot法检测显示，转染组细胞中DHFR蛋白表达水平为10．280±0．009，明显高于阴性对照组及空白对照组（分别为2．050±0．003、3．480±0．003；P〈0．01）。（2）流式细胞仪检测显示，不同浓度（2．5、5．0、10．0、20．0μg／m1）的顺铂作用24、48h后，转染组细胞凋亡率均明显低于阴性对照组和空白对照组（P〈0．05）；而顺铂浓度为5．0、10．0μg／ml作用72h后，转染组细胞凋亡率则明显高于阴性对照组和空白对照组（P〈0．05）。3组细胞经各自IC50的顺铂作用24、48h时，其细胞均以G0／G1期细胞为主，且转染组GJG。期细胞比例明显高于阴性对照组和空白对照组�
- 李状王琪张玮阳志军李力
- 关键词：卵巢肿瘤二氢叶酸还原酶基因表达调控
- 卵巢癌组织中二氢叶酸还原酶基因的表达及其临床意义被引量：3
- 2012年
- 目的:探讨卵巢癌组织中二氢叶酸还原酶基因(dinhydrofolate reductase,DHFR)的表达及其临床意义。方法:采用实时荧光定量PCR法检测80例卵巢癌组织、50例良性卵巢组织及30例正常卵巢组织中的DHFR mRNA表达情况,分析其与卵巢癌临床病理及多药耐药的相关性。结果:1)DHFR mRNA在正常卵巢组织、良性卵巢肿瘤和卵巢癌组织中表达量分别为0.584±0.234、0.895±0.783和0.197±0.412,经比较差异有统计学意义(P<0.001,P=0.027,p<0.001)。2)卵巢癌组织中DHFR mRNA表达量与患者临床分期及病理分级差异无统计学意义(P>0.05),但在上皮性癌中浆液性癌组织中DHFRmRNA表达量则明显高于黏液性和内膜样癌,经比较差异有统计学意义(P<0.001)。3)卵巢癌组织中DHFR mRNA表达量与患者的腹水量、淋巴结转移和远处器官转移无明显相关(P>0.05),但大网膜转移者肿瘤组织中DHFR mRNA表达量则低于无转移者(P=0.044)。4)在卵巢癌患者中治疗后缓解者组织中DHFR mRNA表达量低于肿瘤进展者(P<0.001);而铂类药物敏感型患者肿瘤组织中DHFR mRNA表达量0.130±0.103也低于铂类药物耐药者0.341±0.701(P=0.011)。5)DHFRmRNA表达量判断卵巢肿瘤性质的ROC曲线Youden指数最大值所对应的数值为0.331,DHFR mRNA表达量>0331的患者中位生存时间为16.4个月,而≤0.331的患者中位生存时间为44.5个月,差异有统计学意义(P<0.001),且Cox模型多因素分析亦显示DHFR mRNA表达量为影响预后的独立因素(P=0.018)。结论:DHFR mRNA在正常和良性卵巢组织中表达量高于卵巢癌组织,提示DHFR参与正常组织细胞生理代谢,而在卵巢癌中DHFRmRNA在铂类耐药组织中表达较高,在铂类敏感组织表达低,提示DHFR与卵巢癌多药耐药相关。
- 李状王琪张玮阳志军唐步坚黄明钜李力
- 关键词：卵巢癌实时荧光定量PCR预后分析
- 卵巢肿瘤组织MTRR蛋白表达检测及其临床意义被引量：3
- 2013年
- 目的探讨卵巢恶性肿瘤组织中亚甲基四氢叶酸—高半胱氨酸甲基转移还原酶(MTRR)的表达及其临床意义。方法采用Western blot检测80例卵巢恶性肿瘤组织、50例卵巢良性肿瘤组织及40例正常卵巢组织中的MTRR表达情况,分析其与卵巢恶性肿瘤临床病理及多药耐药的相关性。结果 (1)MTRR在卵巢正常组织、卵巢良性肿瘤和卵巢恶性肿瘤中的表达量依次增高(P<0.05)。(2)MTRR在卵巢恶性肿瘤临床分期中Ⅰ～Ⅱ期的表达量低于Ⅲ～Ⅳ期,在组织分级高分化中的表达量低于中低分化(P<0.05)。(3)MTRR在铂类药物耐药型卵巢恶性肿瘤中的表达量高于铂类药物敏感型(P<0.05);在治疗后肿瘤进展者中的表达量高于缓解者(P<0.01)。(4)MTRR在黏液性肿瘤中的表达量低于浆液性肿瘤(P<0.05),在远处器官转移的恶性卵巢肿瘤中高于未有转移者(P<0.01),与患者是否有大网膜转移和腹水量多少无明显相关(P>0.05)。(5)MTRR表达量判断卵巢肿瘤性质的ROC曲线Youden指数最大值为0.681,卵巢恶性肿瘤MTRR表达量的高低与中位生存时间长短差别无明显相关(P>0.05),Cox模型多因素分析显示MTRR表达量不是影响患者生存预后的独立因素。结论 MTRR蛋白过表达与卵巢恶性肿瘤的发生发展相关,MTRR蛋白过表达可作为判断肿瘤性质和铂类多药耐药潜在标志物之一。
- 陈佳王琪张玮黄明距李状阳志军潘忠勉李力
- 关键词：卵巢恶性肿瘤免疫蛋白印迹
