国家高技术研究发展计划(2001AA217101)
- 作品数：11 被引量：44H指数：4
- 相关作者：王成济杨安钢赵晶于翠娟王智更多>>
- 相关机构：第四军医大学第四军医大学唐都医院清华大学更多>>
- 发文基金：国家高技术研究发展计划国家杰出青年科学基金国家重点基础研究发展计划更多>>
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- 人截短型凋亡诱导因子的表达对HeLa细胞的促凋亡作用被引量：5
- 2003年
- 目的:观察人截短型AIF基因的表达对HeLa细胞的促凋亡作用。方法:用RT-PCR法分段克隆全长人AIF基因。经改造截去其N-端线粒体定位信号及部分Spacer区域(1～120位氨基酸)的编码序列,从而获得人截短型AIF(AIF△1-120)基因。将其克隆入pIRES2-EGFP绿色荧光蛋白(EGFP)共表达载体,用脂质体法转染HeLa细胞,通过荧光显微镜观察、 免疫组织化学检测、间接免疫荧光检测、电镜观察等方法,检测目的基因在转染细胞中的表达,以及对转染细胞的形态及生长状况的影响。结果:成功地构建了人截短型AIF(AIF△1-120)基因的真核表达载体。转染HeLa细胞后,可检测到人截短型AIF分子的表达。随着转染后时间的延长,可观察到表达人截短型AIF分子的HeLa细胞呈现典型的凋亡特征。结论:人截短型AIF基因的表达可诱导HeLa细胞凋亡。
- 于翠娟孟艳玲赵晶王智王成济杨安钢
- 关键词：凋亡诱导因子HELA细胞基因表达细胞凋亡
- 重组人凋亡诱导因子基因的构建、表达及其对HeLa细胞的促凋亡作用被引量：13
- 2002年
- 凋亡诱导因子 (apoptosis inducingfactor ,AIF)定位于细胞的线粒体膜间隙 .当凋亡信号刺激时 ,AIF分子从线粒体释放到胞浆 ,然后转位到细胞核内 ,引起染色体核周边凝集和DNA呈大片段断裂 (～ 5 0kb) .用RT PCR法分段克隆得到人全长AIF基因 ,经改造截去其N端线粒体定位信号编码序列 ,代之以不同长度的绿脓杆菌外毒素 (PE)转膜结构域序列 .把这些重组基因克隆入 pIRES2 EGFP真核表达载体 ,脂质体法转染HeLa细胞 ,通过荧光显微镜观察、共聚焦显微镜观察、电镜观察等方法检测了多种重组人AIF基因的表达及其对细胞生长的影响 .证明了重组人AIF基因的表达可引起HeLa细胞死亡 。
- 于翠娟孟艳玲桂俊豪赵晶金明王智王成济杨安钢
- 关键词：HELA细胞促凋亡作用融合蛋白
- 活性型粒酶B基因的异位表达导致多核巨细胞产生
- 2004年
- 粒酶B (granzymeB ,GrB)是一种重要的丝氨酸蛋白酶参与细胞毒性T淋巴细胞 (CTL)和自然杀伤细胞(NK)介导的细胞杀伤过程 .为研究粒酶B在肿瘤细胞中异位表达后能否诱导细胞死亡 ,将构建的活性型粒酶B(GrBa)基因及其酶活性中心突变型 (mGrBa)基因的真核表达载体 ,以脂质体法瞬时转染HeLa细胞 ,通过绿色荧光蛋白 (GFP)共表达、间接免疫荧光、细胞计数、MTT等方法 ,观察到GrBa蛋白的异位表达引起多核巨细胞形态异常 ,并且表达细胞的生长受到抑制 .Percoll分离多核巨细胞后 ,观察到其生长状态较差 ,是导致生长抑制的直接原因 .细胞骨架破坏和具有多极纺锤体的异常有丝分裂 ,推测是多核巨细胞不断产生的根源 .
- 赵晶陈蕾许彦鸣张淼丽温伟红王成济杨安钢
- 关键词：异位表达多核巨细胞
- 分泌表达的抗ErbB2单链抗体与重构型人半胱氨酸蛋白水解酶3融合蛋白对SKBr3细胞的靶向杀伤作用被引量：1
- 2003年
- 目的 探讨分泌表达的抗erbB2单链抗体与重构型人半胱氨酸蛋白水解酶 (caspase 3)融合蛋白对ErbB2抗原阳性肿瘤细胞的靶向杀伤作用。方法 将重构型人caspase 3基因亚克隆入pCMV e2 3scFv PEII PEIII相应位点 ,构建表达分泌型的抗erbB2单链抗体与重构型人caspase 3融合蛋白基因的真核表达载体 pCMV e2 3scFv PEII revcasp 3,转染人T淋巴瘤细胞系Jurkat,筛选并建系 ,ELISA检测培养上清中融合蛋白的分泌表达以及对人乳腺癌细胞SKBr3生长的抑制作用 ,并将重组质粒经脂质体包裹后肌肉注射荷瘤裸鼠研究其对肿瘤的抑制作用 ,间接免疫荧光检测重构型人caspase 3蛋白在瘤体的靶向分布。结果 融合蛋白基因可通过Jurkat细胞分泌表达并杀伤SKBr3细胞 ,肌肉注射重组质粒明显延长荷瘤裸鼠生存时间 (延长 72 % )和抑制荷瘤裸鼠肿瘤生长 (抑制率为77% )。间接免疫荧光染色显示重构型人Caspase 3融合蛋白具有靶向分布。结论 分泌表达的抗erbB2单链抗体与重构型人Caspase 3融合蛋白靶向诱导SKBr3细胞死亡。
- 张立红贾林涛于翠娟曲萍董海龙赵晶许彦鸣王成济杨安钢
- 关键词：分泌表达融合蛋白靶向杀伤作用CASPASE-3基因疗法
- 重构型caspase-3的表达及其对SKBr3细胞的凋亡诱导作用被引量：2
- 2002年
- 目的:探讨重构型caspase-3基因的表达对肿瘤细胞的凋亡诱导作用。方法:用重组PCR的方法获得大、小亚基顺序颠倒的重构型caspase-3基因并将其克隆入真核表达载体pcDNA3,转染乳腺癌细胞系SKBr3细胞,通过HE染色、流式细胞仪分析及免疫组化等方法观察其表达后对细胞的促凋亡活性,并将载体DNA直接注射荷瘤裸鼠研究其对肿瘤的抑制作用。结果:重构型caspase-3基因可在SKBr3细胞内表达,转染组较同期对照组出现明显的细胞死亡现象,pcDNA3-revcasp-3重组质粒直接注入对荷瘤裸鼠肿瘤生长有明显抑制作用。结论:重构型caspase-3基因表达可诱导SKBr3细胞凋亡。
- 张立红贾林涛陈广生曲萍于翠娟赵晶许彦鸣王成济杨安钢
- 关键词：凋亡SKBR3乳腺癌肿瘤细胞
- 截短型人Bid融合蛋白对HeLa细胞的促凋亡作用被引量：12
- 2003年
- 目的 :观察截短型人bid及其N端融合蛋白的表达对HeLa细胞的促凋亡作用 .方法 :通过反转录PCR方法获取人全长bid基因 ,再经PCR方法克隆得到截短型bid(trun catedbid ,tbid)基因及其N端融合蛋白基因插入pcDNA3真核表达载体 ,脂质体法转染HeLa细胞 ,通过间接免疫荧光 ,电子显微镜以及流式细胞仪等方法观察被转染细胞的生长及凋亡状况 .结果 :成功获得人bid基因 ,构建了tbid基因及tbid与绿脓杆菌外毒素 (PE)转膜结构域部分肽段的融合蛋白基因的真核表达载体 (pcDNA3 tbid6 1 ,pcDNA3 PE tbid6 1 ) .与对照组相比 ,在转染后 1 2～ 4 8h内两种基因的表达均导致HeLa细胞发生凋亡 ,且两者活性相当 .结论
- 裘秀春于翠娟许彦鸣贾林涛曹云新王智王成济范清宇杨安钢
- 关键词：细胞凋亡HELA细胞促凋亡作用基因表达
- 免疫Caspase-6对HER2阳性肿瘤特异性杀伤的研究
- caspase-6是天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶家族的成员,属于效应Caspase分子,是哺乳动物细胞凋亡中重要的执行分子之一。Caspase-6通常以无活性的酶原形式合成,只有当凋亡信号刺激时,上游分子被激活后,才经剪...
- 许彦鸣王立锋贾林涛赵晶张立红王成济杨安钢
- 关键词：逆转录病毒腺病毒
- 文献传递
- 两种人粒酶B嵌合基因的表达及对肿瘤细胞的杀伤作用
- 2004年
- 通过重组PCR构建了抗HER2单链抗体基因、绿脓杆菌外毒素 (PE)转位肽序列和活性型粒酶B(GrBa)基因相融合的sFv2 3e PEⅡ GrBa基因 ,以及N端包含PE部分转位肽序列的PEⅡ GrBa基因 .将这 2种粒酶B嵌合蛋白基因瞬时转染或稳定转染HeLa细胞及SKBR 3细胞 .通过间接免疫荧光、细胞计数、MTT、ELISA等方法 ,观察到细胞浆中表达的PEⅡ GrBa蛋白直接杀伤其表达细胞 ;而sFv2 3e PEⅡ GrBa表达后被分泌至细胞外 ,对产生它的细胞没有杀伤性 ,但能够特异识别并杀伤HER2阳性肿瘤细胞 .结果表明 ,抗肿瘤表面抗原的抗体能够介导靶向识别 ,转位结构域可以辅助效应分子活化、转位至细胞液并杀伤细胞 ,为肿瘤的靶向治疗提供了新的策略 .
- 赵晶王智贾林涛张立红金明王成济杨安钢
- 关键词：PE肿瘤细胞杀伤作用肿瘤结构域
- N端融合不同长度转位肽的重组粒酶B抑制细胞生长作用的比较
- 2004年
- 采用重组PCR法将粒酶B基因的N端信号肽和酸性二肽编码序列去除 ,与两种不同长度的绿脓杆菌外毒素 (PE)转位肽序列分别连接 ,将它们插入pIND诱导表达载体 ,通过脂质体法与pVgRXR辅助质粒共转染HeLa细胞 ,建立了重组PEII GrBa基因的诱导表达细胞系。松甾酮A诱导后Western印迹检测到目的基因的表达 ,间接免疫荧光观察到表达细胞出现多核巨细胞的异常形态。两种表达的PEII GrBa融合蛋白均能够切割粒酶B的细胞内源性和外源性底物 ,并且使细胞生长速度减慢。其中 ,PEII (aa 2 80 35 8) GrBa的底物切割能力和生长抑制作用较强。流式细胞仪分析这种抑制作用可能与细胞周期的G2 期受到阻遏有关。上述结果证实了PEII GrBa融合蛋白仍然具有抑制细胞生长的作用 ,并且较短的转位肽对GrBa活性的影响较小 ,有助于进一步优化转位肽
- 赵晶王智于翠娟曹云新张莉王成济杨安钢
- 关键词：绿脓杆菌外毒素
- 瞬时转染和稳定转染对RNAi抑制乙型肝炎病毒S基因表达的影响被引量：11
- 2005年
- 目的:构建针对乙型肝炎病毒(HBV)S基因的siRNA表达载体pSUPERS1和pSUPERS2,观察瞬时转染及稳定转染对RNAi抑制HBV基因表达作用的影响.方法:设计并合成针对HBVS基因的siRNA寡核苷酸,经退火形成双链后克隆入pSUPER载体,构建成功的siRNA表达载体分别瞬时转染和稳定转染表达HBV的2.2.15细胞,对所得细胞上清中的HBsAg和HBeAg进行定量检测,RTPCR检测siRNA对靶基因mRNA的抑制效果,并比较两种转染方式对RNAi抑制HBV基因表达作用的影响.结果:在稳定转染并经潮霉素筛选所得的单克隆细胞株中,pSUPERS1和pSUPERS2均能明显抑制HBsAg及HBeAg的分泌(P<0.01),抑制率分别为83%和78%,RTPCR结果证实HBV的mRNA明显降低,而瞬时转染细胞在蛋白质水平上及mRNA水平上的结果则比稳定转染的结果逊色.结论:针对HBVS基因的siRNA能稳定、高效、特异地抑制HBV基因的表达,转染效率对于靶基因的RNA干涉作用有明显的影响.
- 刘家云李庆霞黄红艳马龙洋鲍炜贾林涛薛采芳刘军王成济杨安钢
- 关键词：乙型肝炎病毒RNA干涉转染
