国家自然科学基金(30471699)
- 作品数：4 被引量：6H指数：1
- 相关作者：周宁新张效东刘军桂陈雄飞徐东刚更多>>
- 相关机构：中国人民解放军第二炮兵总医院辽宁医学院中国人民解放军总医院更多>>
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- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 胆管癌相关FXYD6基因功能区在大肠埃希菌表达的初步研究
- 2010年
- 目的对胆管癌相关基因FXYD6基因的功能区进行克隆和表达,以便进一步展开该基因功能研究。方法借助生物信息学方法分析FXYD6基因,设计FXYD6基因信号肽剪切后功能区蛋白体外表达序列,并将其克隆到pBV220表达载体上,继而以大肠埃希菌为表达系统,使功能区蛋白(不含信号肽)获得体外表达。结果该基因主要功能位点位于18～95 aa。PCR扩增出剪切掉信号肽序列的功能区序列(即包含18～95 aa的肽链段),并成功构建pBV220/FXYD6-ex基因功能区重组表达质粒克隆,其在大肠埃希菌DH5α中表达量最高,表达产物主要以包涵体形式存在。结论获得胆管癌相关FXYD6基因融合蛋白表达产物,为后续研究打下基础。
- 万涛周宁新徐东刚吴加金黄志强
- 关键词：胆管癌功能区
- 离子通道相关蛋白FXYD6功能区的原核表达及纯化被引量：1
- 2010年
- 目的构建FXYD6蛋白功能区(FXYD6-ex)的原核表达质粒,并诱导FXYD6-ex在原核细胞中表达与纯化,以进一步研究FXYD6功能。方法用全长FXYD6 cDNA扩增FXYD6-ex,扩增产物插入克隆质粒载体pMD18-T Simple并用限制性内切酶酶切,将目的片段插入以限制性内切酶切后的表达质粒载体pET28a(+)中,经PCR电泳和测序证实后转化宿主大肠杆菌Rossetta,异丙基-β-8-D硫代半乳糖(IPTG)诱导重组蛋白表达,镍柱纯化重组蛋白,十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝胶和Western blot检测鉴定蛋白表达及纯化情况。结果成功构建pET28a(+)-FXYD6-ex大肠杆菌表达载体,并实现该蛋白在大肠杆菌中的高表达,分离纯化的产物纯度达90%。结论本研究成功对FXYD6-ex进行原核表达及纯化;此为后续制备该蛋白抗体库及进一步研究其具体功能奠定了良好基础。
- 陈雄飞周宁新
- 关键词：蛋白表达蛋白纯化
- 抗人FXYD6单克隆抗体的制备及鉴定
- 2009年
- 制备了抗人FXYD6单克隆抗体,并进行初步鉴定。以FXYD6合成多肽作为免疫原,利用单克隆抗体杂交瘤技术建立阳性克隆细胞株;腹水诱导法制备抗人FXYD6单克隆抗体;蛋白A亲合层析法纯化;ELISA测定FXYD6单克隆抗体的特异性和效价;以所得特异性抗体为一抗,利用免疫组化法检测胰腺癌组织中FXYD6的表达。结果成功获得1株稳定分泌特异性抗人FXYD6单克隆抗体的杂交瘤细胞株;腹水诱导法生产抗人FXYD6单克隆抗体2.86mg;FXYD6单克隆抗体可以与FXYD6合成多肽特异性结合,抗体效价1:5400;免疫组织化学显示胰腺癌组织中胞膜呈阳性染色。成功获得FXYD6单克隆抗体可以为进一步研究FXYD6的组织分布、生物学作用创造条件。
- 刘军桂周宁新张效东
- 关键词：单克隆抗体酶联免疫吸附测定免疫组织化学
- FXYD6 shRNA表达载体的构建及其在体外对胰腺癌细胞增殖的影响被引量：5
- 2009年
- 目的:构建FXYD6短发夹RNA(shRNA)表达载体,体外评价其对胰腺癌细胞sw1990的增殖与FXYD6蛋白表达的抑制效果。方法:基于microRNA mir-30天然结构,设计表达4对FXYD6shRNA的互补DNA序列,克隆入pCGM30质粒载体,连接产物转化感受态大肠杆菌DH5α,PCR法筛选阳性克隆,经酶切和基因测序鉴定;利用LipofectAMINE2000将pCGM30-FXYD6shRNA转染至胰腺癌细胞sw1990,MTT法检测转染后胰腺癌细胞增殖的变化,Western blot检测胰腺癌细胞中FXYD6蛋白表达水平的变化。结果:设计合成了4对表达FXYD6shRNA的互补DNA序列,构建了4个表达FXYD6shRNA的重组质粒;基因测序证实shRNA编码序列与设计的片段完全一致,酶切鉴定证实载体构建成功;体外实验表明,转染胰腺癌细胞sw1990的增殖能力和FXYD6蛋白表达水平明显降低(P<0.05),FXYD6蛋白表达水平随时间延长逐渐降低(P<0.01),但细胞增殖能力无明显变化(P>0.05)。结论:构建了4个表达FXYD6shRNA的重组质粒载体,可有效抑制FXYD6的表达;抑制胰腺癌细胞sw1990中FXYD6的表达可以抑制细胞的增殖,提示FXYD6可能是一个具有潜在临床应用价值的基因治疗靶点。
- 刘军桂周宁新张效东
- 关键词：RNA干扰短发夹RNA胰腺癌
