国家自然科学基金(30471623)
- 作品数：8 被引量：14H指数：2
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- 相关机构：青岛大学青岛大学医学院附属医院青岛市疾病控制中心更多>>
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- 靶向LMP1基因siRNA作用对AP-1及其相关因子表达的影响
- 2008年
- 背景与目的:潜伏膜蛋白LMPl是EBV基因组BamH I Nhet片段上BNLF1编码的一种跨膜蛋白,它是发现最早的能在体外恶性转化细胞系的EBV潜伏期蛋白。本研字己旨在探讨LMP1沉默对AP-1信号转导通路及其下游与细胞转化、增殖和凋亡等相关因子转录表达的影响。方法:应用50 nmol/L靶向LMP1功能区编码序列的siRNA649转染EBV阳性的胃癌上皮细胞GT38,分别作用24、48、72、96、120 h,采用RT-PCR检测c-Jun,生存素,CDK4和MMP9 mRNA转录水平;免疫组化法检测细胞生存素蛋白表达;Western印迹法检测c-Jun,JunB和CDK4蛋白表达。结果:靶向LMP1特异性siRNA作用后,各时间点c-Jun和生存素mRNA水平均明显低于细胞对照组(P<0.05),c-Jun以24 h时降低最为明显,而生存素以48 h时降低最为明显;CDK4 mRNA水平均明显高于细胞对照组(P<0.05);转染后24、48、72 h时MMP9 mRNA表达水平均明显低于细胞对照组(P<0.05),96 h和120 h时MMP9则无明显改变(P>0.05)。与细胞对照比较,c-Jun和JunB蛋白表达均下调,JunB蛋白表达在作用第5天时有所恢复,CDK4蛋白表达均上调。免疫组化检测结果显示转染后细胞质中代表生存素阳性的棕色颗粒明显减少。结论:靶向LMP1功能区编码序列的siRNA转染可影响EBV阳性胃上皮细胞AP-1及其下游相关因子的表达,进而抑制细胞增殖,促进细胞凋亡。
- 刘霞王笑峰王云李欣冯艺罗兵
- 关键词：EB病毒潜伏膜蛋白1活化蛋白-1
- 特异性沉默EBV潜伏期基因LMP1 pSUPER retro RNAi系统的构建被引量：2
- 2006年
- 目的构建并筛选携带针对Epstein-Barr病毒(EBV)潜伏膜蛋白基因LMP1的pSUPER retroRNAi逆转录病毒载体以及稳定产毒的细胞克隆。方法用DNA重组技术,将60 bp能转录产生靶向LMP1小发夹RNA(shRNA)的寡核苷酸序列,定向克隆入逆转录病毒载体pSUPER retro,脂质体法将重组逆转录病毒载体转染包装细胞系PA317,G418筛选建立稳定产生逆转录病毒的细胞克隆。结果重组逆转录病毒载体经限制性内切酶酶切,电泳后可观察到7 167 bp和281 bp两条DNA条带;测序鉴定结果表明序列正确;重组载体转染包装细胞,可表达绿色荧光蛋白,经G418筛选,得到抗性细胞克隆。结论特异性沉默EBV潜伏期基因LMP1的pSUPER retro RNAi逆转录病毒载体以及稳定产毒的细胞系构建和筛选成功。
- 殷凡王笑峰罗兵
- 关键词：LMP1逆转录病毒载体EPSTEIN-BARR病毒
- LMP1基因沉默对EBV阳性上皮细胞凋亡和增殖影响被引量：3
- 2008年
- 目的探讨化学合成小干涉RNA(siRNA)对Epstein-Barr病毒(EBV)潜伏膜蛋白1(LMP1)阳性胃上皮(GT38)细胞LMP1编码基因表达的抑制作用,以及对细胞增殖和凋亡的影响。方法化学合成靶向LMP1mRNA不同位点的3对siRNA,分别转染GT38细胞,选择干扰效果最佳的siRNA进行实验研究,行RT-PCR、Hochest 33258荧光染色及流式细胞术分析。结果RT-PCR结果显示,3对靶向LMP1的siRNA均能抑制GT38细胞LMP1的转录表达,以靶向LMP1 mRNA 649位点的siRNA作用效果最强。Hochest 33258荧光染色可见siRNA649作用后的GT38细胞发生凋亡。流式细胞分析显示,siRNA649作用24、72以及120 h后的细胞其细胞周期无明显改变。RT-PCR检测结果表明,转染siRNA649的靶细胞Bcl-2的表达水平降低。结论靶向LMP1的特异性siRNA可以有效抑制LMP1的转录表达,进而可能通过抑制Bcl-2的表达诱导靶细胞凋亡。GT38细胞系可作为研究LMP1生物活性及其在EBV相关肿瘤发生中所起作用的理想的靶细胞。
- 冯艺王笑峰王云罗兵
- 关键词：潜伏膜蛋白1小干涉RNA
- 靶向EBV潜伏期基因EBNA2小干涉RNA系统的构建
- 2007年
- [目的]构建携带靶向EBV核抗原EBNA2(EBV nuclear antigen,EBNA)的pSUPER.retroRNAi逆转录病毒载体,进而筛选出稳定产毒的细胞克隆。[方法]用DNA重组技术将60nt能转录产生靶向EBNA2小发夹RNA(smallhairpin RNA,shRNA)的寡核苷酸序列定向插入逆转录病毒载体pSUPER.retro,并用限制性内切酶酶切和测序鉴定;脂质体法将重组逆转录病毒载体转染包装细胞系PheonixA,G418筛选稳定产生逆转录病毒的细胞克隆。[结果]重组逆转病毒载体经限制性内切酶酶切,电泳后可观察到7167bp和281bp两条DNA条带;测序鉴定结果表明序列正确;重组载体转染的包装细胞经G418筛选获得能产生逆转录病毒的抗性细胞克隆,病毒滴度为2.5×104CFU/ml。[结论]成功构建和筛选出靶向EBV潜伏期基因EBNA2的pSUPER retroRNAi逆转录病毒载体以及稳定产毒的细胞系,为深入探讨EBNA2基因的细胞转化和抗凋亡作用提供了实验基础。
- 孙淑红胡晓峰王笑峰殷凡罗兵
- 关键词：小发夹RNA逆转录病毒载体EB病毒
- EB病毒早期基因BHRF1—Bcl-2的病毒性同源基因被引量：3
- 2005年
- BHRF1是近年来得到确认的EBV新的致癌基因,在结构上和功能上与细胞原癌基因Bcl-2相似,属Bcl-2家族成员。由于其抑制细胞凋亡和细胞转化作用而受到广泛关注,本文就BHRF1的作用特点、与bcl-2的关系以及应用前景作一综述。
- 殷凡孙萍罗兵
- 关键词：同源基因EB病毒病毒性原癌基因BCL-2BHRF1BCL-2
- 潜伏膜蛋白1基因特异性沉默对EB病毒阳性胃上皮细胞影响的初步研究被引量：2
- 2008年
- EB病毒（Epstein-Barr virus，EBV）是重要的DNA肿瘤病毒。潜伏膜蛋白1（latent membrane protein 1，LMP1）编码基因是EBV永生化基因中惟一能够转化体外培养的人和啮齿类动物细胞并使之具有致瘤性的基因。本研究选择EBV阳性胃上皮细胞GB8作为靶细胞，采用人工合成的小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）特异性阻断LMP1的表达，检测LMP1基因沉默对G338增殖和凋亡的影响，探讨LMP1在EBV相关肿瘤发生发展中的分子机制，为EBV相关肿瘤的生物治疗提供实验依据。
- 冯艺王笑峰王云罗兵
- 关键词：潜伏膜蛋白1基因特异性EB病毒DNA肿瘤病毒LMP1
- EB病毒潜伏膜蛋白LMP1编码基因沉默对NF-κB表达的影响被引量：2
- 2009年
- 目的:探讨EBV阳性胃上皮细胞中潜伏膜蛋白1(latent membrane protein1,LMP1)基因沉默对NF-κB转录表达的影响。方法:以稳定表达LMP1的EBV阳性胃上皮细胞系作为靶细胞,采用化学合成的siRNA特异性沉默LMP1,用RT-PCR和West-ern-blotting分别检测其在不同时间段mRNA和蛋白水平特异性沉默效果;Western blotting及免疫酶染色法检测LMP1基因沉默对NF-κB转录表达及核转移的影响。结果:siRNA在mRNA和蛋白水平可特异性沉默LMP1的表达,且有时间效应关系;West-ern blotting及免疫酶染色法检测结果显示LMP1沉默可干扰NF-κB表达,导致靶细胞核内NF-κB水平下降,细胞浆内水平升高,而NF-κB总蛋白有下降趋势。结论:LMP1基因特异性沉默能够影响NF-κB表达,抑制其核转移。
- 李欣王笑峰刘霞冯艺罗兵
- 关键词：EB病毒潜伏膜蛋白1NF-KB小干涉RNA
- TGF-β1参与调控LMP1介导信号转导通路的研究被引量：2
- 2013年
- 目的探讨转化生长因子β1(TGF-β1)和EB病毒(EBV)潜伏期膜蛋白1(LMP1)在EBV相关胃癌发生中的作用及其机制。方法设计合成靶向LMP1的siRNA649转染EBV阳性胃癌细胞系GT38,并与TGF-β1联合作用,RT-PCR检测LMP1沉默和TGF-β1作用对LMP1介导的信号转导通路相关因子转录表达的影响。结果与细胞对照和脂质体对照比较,siRNA649、siRNA649+TGF-β1分别作用GT38细胞系后,基质金属蛋白酶9(MMP9)、生存素(Survivin)和细胞黏附分子1(ICAM-1)表达降低,而细胞周期依赖性激酶4(CDK4)表达升高,差异均有显著性(F=10.48～26.23,P<0.05);siRNA649+TGF-β1联合作用后表皮生长因子受体(EGFR)表达水平显著高于对照组(F=9.47,P<0.05),而siRNA649组与对照组比较差异无显著性(P>0.05)。TGF-β1作用EBV阳性细胞系(GT38和SNU719)和EBV阴性细胞系(SGC7901和HGC-27),与对照组相比GT38细胞中ICAM-1表达显著降低,差异有显著性(F=30.36,P<0.05),其他细胞中ICAM-1的表达差异无显著性(P>0.05);4种细胞系TGF-β1作用前后MMP9、Survivin、CDK4和EGFRmRNA转录表达差异均无显著意义(P>0.05)。结论 LMP1可以调控MMP9、Survivin和CDK4表达,LMP1与TGF-β1相互作用可调控ICAM-1和EGFR的转录表达。
- 张少燕刘霞王笑峰王云罗兵
- 关键词：转化生长因子Β
