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奥利亚罗非鱼外周血白细胞分离与血细胞指数研究: 2008年; 鱼类外周血白细胞分离一直是一项技术难题，为探讨一种便捷、高效的奥利亚罗非鱼外周血白细胞分离方法，本实验使用76％泛影葡胺（Urografin）调整标准人淋巴细胞分离液比重，通过梯度密度离心筛选最佳奥利亚罗非鱼白细胞分离液比重，并对分离前后的细胞进行分类计数与形态观察。结果发现分离前奥利亚罗非鱼外周血细胞总数为1．5×10^9个／ml，白细胞占35％，最佳奥利亚罗非鱼白细胞分离液比重为1．082，每毫升外周血可分离得到6×10^6～8×10^6个细胞，其中白细胞可达90％以上。对分离前后的细胞进行瑞氏染色分析可明显区分出单核细胞、大淋巴细胞、小淋巴细胞和嗜中性粒细胞，且各类白细胞之间的比例分离前后基本一致。本研究成功建立了奥利亚罗非鱼外周血白细胞分离技术，测定奥利亚罗非鱼血细胞指数，并对血细胞进行了形态学观察与鉴定，这对罗非鱼细胞免疫学研究具有一定的实际意义。; 李超陈明黄维义余晓丽王瑞雷爱莹黄婷秦春香梁万文; 关键词：奥利亚罗非鱼外周血白细胞

用链球菌疫苗免疫罗非鱼前后其差异表达基因的鉴定与分析被引量：5: 2009年; 采用抑制性差减杂交技术(SSH)成功构建了罗非鱼O reochrom is nilotica被链球菌Streptococcus iniae疫苗免疫前后正、反两个淋巴细胞cDNA差减文库,富集了免疫过程中表达谱发生变化的淋巴细胞基因,并对文库进行了斑点杂交筛选、测序和ESTs初步分析。结果表明:文库富集了高丰度的差异表达基因,阳性率较高。正向文库中筛选得到21个免疫期间表达丰度上调的基因,其中1个基因与罗非鱼已知基因具有相似性,10个基因与其他鱼类已知基因相似,1个基因与其他物种已知基因具有相似性,9个为未知新基因;负向文库中筛选得到24个免疫期间表达丰度下调的基因,其中3个与罗非鱼已知基因具有相似性,15个与其他鱼类已知基因相似,6个为未知新基因。进一步功能注解发现,正向文库功能基因包括免疫信号传导相关蛋白、防御相关蛋白、肿瘤免疫相关蛋白和淋巴细胞相关蛋白,这些基因免疫后表达丰度升高,提高了机体免疫抵抗力。负向文库功能基因包括细胞免疫相关蛋白、感染相关蛋白和肿瘤发生相关蛋白,这些基因免疫后表达丰度降低,可以降低机体感染和发病几率。; 李超陈明李莉萍黄维义余晓丽黄婷张彬雷爱莹陈福艳梁万文; 关键词：罗非鱼链球菌疫苗差减文库免疫相关基因

罗非鱼免疫前后白细胞cDNA差减文库的构建及鉴定被引量：9: 2010年; 为筛选罗非鱼链球菌疫苗免疫前后白细胞表达变化基因及探讨鱼类白细胞免疫机理,利用抑制性差减杂交(SSH)技术,以链球菌疫苗免疫前后罗非鱼白细胞cDNA为材料,构建了罗非鱼免疫前后正、负2个cDNA差减文库,并采用地高辛(DIG)标记差减文库cDNA作为探针,进行差异表达片段的筛选鉴定。结果显示:2个文库重组率均在90%以上,插入片段在300～900 bp,接头连接效率超过50%,差减效率非常高效,阳性率均超过70%。杂交筛选后正、负文库各挑选30个阳性克隆进行测序组装聚类,正、负文库各获得16和18条非冗余EST(unigene),所得序列经GenBank同源性分析,正、负文库各有10和11条unigene获得功能注释,且各有6和7条unigene没有同源性匹配,为未知新基因。; 李超陈明李莉萍黄维义余晓丽黄婷张彬雷爱莹陈福艳梁万文; 关键词：罗非鱼链球菌差减文库

罗非鱼外周血白细胞分离与血细胞指数研究被引量：3: 2009年; 采用Ficoll-Urografin法探讨了罗非鱼外周血白细胞的最佳分离条件,并通过瑞氏染色和细胞分类计数对罗非鱼外周血血细胞指数进行测定。结果表明:罗非鱼最佳白细胞分离条件为18℃,且细胞分离液的相对密度为1.082;分离前罗非鱼外周血血细胞总数为1.5×109个/mL,红细胞约占65%,白细胞约占35%,其中小淋巴细胞、大淋巴细胞、嗜中性粒细胞和单核细胞比例分别是5.81%、12.79%、12.79%和1.16%;每毫升外周血可分离得到(1.3~1.5)×107个细胞,其中白细胞可达90%以上,用瑞氏染色可明显区分出单核细胞、大淋巴细胞、小淋巴细胞、嗜中性粒细胞和血栓细胞,但嗜碱性和嗜酸性细胞较难分辨,且各类白细胞之间的比例分离前后保持一致。血细胞指数测定显示,单核细胞最大,其次为嗜中性粒细胞和红细胞,淋巴细胞和血栓细胞最小,各类血细胞指数与鲤科鱼类同源性较高。; 李超陈明王瑞黄维义余晓丽黄婷雷爱莹梁万文; 关键词：罗非鱼外周血白细胞

尼罗罗非鱼外周血白细胞总RNA的分离及反转录验证: 2010年; 应用Trizol一步法对尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）外周血白细胞总RNA提取方法进行优化,通过β-ac-tin基因反转录对所分离到的总RNA进行质量验证,并对mRNA的冻干浓缩进行了探讨,确定了一套快速、高效的尼罗罗非鱼外周血白细胞总RNA分离和mRNA浓缩体系。结果显示：获得的总RNA纯度较高,OD260/OD280均在1.9-2.0之间;甲醛变性电泳显示,总RNA完整性良好,28S与18S比值为2∶1;总RNA的分离量与起始白细胞量成正比,每毫升Trizol最大裂解量为1×10^8个白细胞,可得到总RNA量约为90μg;总RNA的分离量在前四个小时随着沉淀时间的增长而增加,并成功进行了β-actin基因的反转录。mRNA的分离率为1.08%,通过冻干浓缩成功使其浓度提高9倍。结果表明：分离到的总RNA质量可充分满足下游分子生物学实验要求,所建立的mRNA浓缩方法简单易行,可完全解决mRNA起始浓度低的难题。; 李超陈明黄维义王瑞余晓丽黄婷雷爱莹梁万文; 关键词：外周血白细胞总RNA

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农业部水生动物遗传育种和养殖生物学重点开放实验室开放基金(BZ2007-05)

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