国家自然科学基金(30371399)
- 作品数：7 被引量：23H指数：4
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- 全人源肝癌噬菌体单链抗体的筛选及特异性鉴定被引量：4
- 2005年
- 目的对全人源肝癌噬菌体单链抗体库进行鉴定,筛选肝癌抗体,同时对抗体的活性及特异性进行鉴定。方法PCR鉴定阳性重组菌TG1中人肝癌ScFv的插入率。先以人成纤维细胞吸附后再以体外培养的肝癌细胞SMMC7721为抗原对所建抗体库进行3轮“吸附洗脱扩增”的亲和筛选。将筛选后的ScFv进行PCR鉴定及双酶切鉴定;通过ELISA法及FCM鉴定其与人肝癌细胞及正常细胞的结合活性。结果ScFv基因插入率为70%。在亲和筛选过程中,肝癌噬菌体单链抗体得到富集,收获率逐轮得到提高,第3轮为第1轮的214倍。筛选后的ScFv进行PCR鉴定及双酶切鉴定,均可检测到目的基因。ELISA分析结果显示18个克隆与SMMC7721呈阳性反应,阳性率为90%,15个克隆与成纤维细胞有交叉反应。得到3株肝癌单链抗体。ScFv的FCM鉴定表明,以正常胎肝细胞L02为对照,ScFv与肝癌结合比率为41.3%。特异性鉴定表明,其与肝癌细胞结合活性明显高于正常细胞。结论利用噬菌体抗体库技术结合减数筛选得到了肝癌噬菌体单链抗体及其基因,且筛选后的抗体片段与人肝癌细胞有特异性的结合活性。
- 薛国柱窦科峰赵爱志药立波
- 关键词：噬菌体抗体库单链抗体肝肿瘤
- 全人源肝癌噬菌体单链抗体基因的克隆及活性分析
- 2005年
- 从噬菌体单链抗体库中筛选克隆全人源肝癌抗体基因并进行活性鉴定。PCR鉴定阳性重组菌中人肝癌ScFv的插入率,以肝癌细胞SMMC-7721为抗原对所建抗体库进行4轮“吸附-洗脱-扩增”的亲和筛选。将筛选后的ScFv采用ELISA法鉴定其与人肝癌细胞的结合活性。ScFv基因插入率为70%。在亲和筛选过程中,肝癌噬菌体单链抗体得到富集,收获率逐轮提高,第4轮为第一轮的381倍。利用噬菌体抗体库技术筛选出了肝癌噬菌体单链抗体,且筛选后的抗体片段与人肝癌细胞有特异性的结合活性。
- 薛国柱窦科峰赵爱志药立波
- 关键词：噬菌体抗体库抗体单克隆肝肿瘤
- 噬菌体抗体库筛选技术研究进展被引量：5
- 2005年
- 薛国柱窦科峰
- 关键词：抗体抗体筛选肿瘤
- 两种菌落聚合酶链反应在抗体库筛选中的应用比较被引量：4
- 2004年
- 目的 :探讨两种菌落PCR方法在抗体库筛选中的应用价值。 方法 :分别以 5个阳性克隆细菌菌落直接悬浮于去离子水中及悬浮于含 0 .1%的TritonX 10 0后经水浴煮沸作为模板 ,进行PCR反应。同时提取质粒DNA ,进行双酶切鉴定。 结果 :5个克隆的菌落PCR及酶切鉴定均检测到目的基因。 结论 :菌落PCR可用于筛选阳性重组克隆。
- 薛国柱窦科峰吕勇刚药立波
- 关键词：聚合酶链反应菌落抗体库目的基因
- 肝癌患者血浆RASSF1A异常甲基化检测的意义被引量：7
- 2006年
- 目的采用甲基化特异性PCR法(MSP)检测41例原发性肝癌(HCC)患者血浆中游离Ras相关结构域家族蛋白1A(RASSF1A)异常高甲基化情况,探讨血浆RASSF1A检测在肝癌诊断中的意义.方法收集患者血浆,提取游离DNA,亚硫酸氢钠修饰并纯化,以甲基化特异性引物及非甲基化引物进行PCR.结果41例患者血浆中有17例RASSF1A呈现异常高甲基化(41.5%),对照血浆均为阴性.患者一般情况、临床病理资料等与血浆中RASSF1A异常高甲基化检测结果无关(P>0.05);在10例AFP阴性的HCC患者中,有7例结果为阳性.结论血浆RASSF1A甲基化检测对肝癌的早期诊断及筛选有重要意义,并有助于判断预后.
- 赵强子祁志芳魏万礼李开宗窦科峰
- 关键词：肝肿瘤RASSF1A基因甲基化血浆
- 人乳腺癌全套抗体可变区基因的扩增与克隆被引量：3
- 2004年
- 目的 扩增人乳腺癌抗体全套可变区基因 ,将其克隆到T载体来构建T载体文库。方法 收集乳腺癌患者外周转移淋巴结 30例 ,TRIzol法提取总RNA、纯化mRNA ,行RT PCR扩增 ,制备T载体 ,用于PCR产物的克隆。结果 总RNA纯度高 ,完整性好 ,mRNA获得率为 1%。经RT PCR ,VH、Vλ、Vκ的每一条 5 '端引物均与其相应的 3'端引物成功地扩增出了可变区基因片段 ,轻、重链T载体库分别为 1.7× 10 8和 3.5× 10 8。结论 所采用的引物能够10 0 %扩增目的片段 ,T载体过渡能显著提高克隆效率 ,为噬菌体抗体库的构建和筛选奠定了基础。
- 吕勇刚窦科峰吴昱彤赵爱志刘杰陈刚陶开山药立波
- 关键词：聚合酶链式反应乳腺癌抗体基因T载体
- 大容量人乳腺癌单链抗体库的构建与初步鉴定被引量：4
- 2006年
- 目的利用细胞内重组技术构建大容量人乳腺癌单链抗体(scFv)库。方法收集30例乳腺癌外周转移淋巴结,依次提取总RNA、mRNA,RT-PCR扩增全套可变区基因(VL、VH),各自克隆到T载体,构建T载体库。然后从T载体上酶切VL、VH分步克隆到噬粒载体pDAN5,经电转化TG1得到初级库。辅助性噬菌体感染初级库,使噬菌体抗体表面呈现。提纯噬菌体抗体,滴定浓度后感染大肠杆菌BS1365进行细胞内重组。噬菌体挽救后再次提纯滴定噬菌体,感染大肠杆菌DH5αF',得到次级库,并测序验证。结果VH、VLT载体库分别为3.5×108和1.7×108,初级库库容量2.5×109。次级库库容量为2.5×1011。结论所采用的引物能够高效扩增目的片段,T载体的应用能够提高抗体基因的克隆效率,细胞内重组将进一步扩大库容量及增加其多样性,这种基于RT-PCR、T载体过渡、细胞内重组的路线能够构建大容量抗体库。
- 吕勇刚窦科峰吴昱彤赵爱志陶开山韩月恒杨雁灵刘杰陈刚药立波
- 关键词：噬菌体抗体库单链抗体乳腺癌
