国家自然科学基金(30371468)
- 作品数：6 被引量：5H指数：2
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- 相关机构：第三军医大学西南医院更多>>
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- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- EOLA1基因小干扰RNA载体构建及其干扰效应检测被引量：1
- 2004年
- 目的 构建人类新基因内皮高表达脂多糖相关因子 1(EOLA1)特异性的小干扰RNA表达载体 ,并初步验证其对靶基因的抑制作用。方法 构建绿色荧光蛋白 (GFP) EOLA1融合蛋白表达载体pEGFP N2 /EOLA1,并转染人ECV30 4细胞株 ,G4 18压力筛选获得稳定表达株 ;针对靶基因EOLA1,设计靶点特异性的寡核苷酸 ,插入pSlincer3.1/H1质粒。转染重组质粒到稳定表达GFP EOLA1融合蛋白的ECV30 4细胞 ,通过观察转染细胞绿色荧光的强弱和Westernblot实验检测靶基因的抑制情况。结果 获得了稳定表达GFP EO LA1融合蛋白的细胞株 ,构建的小RNA干扰质粒siEOLA1能够抑制靶基因EOLA1的表达。结论 成功构建了针对EOLA1基因的siR NA质粒 ,为进一步研究该基因的功能奠定了基础。
- 刘月明杨宗城梁自文苏踊跃罗向东陈渝
- 关键词：靶基因ECV304细胞转染小干扰RNA
- 人内皮细胞高表达脂多糖相关因子1蛋白的纯化被引量：3
- 2005年
- 目的探讨通过金属螯合亲和层析的方法获得高纯度的人内皮细胞高表达脂多糖相关因子1(EOLA1)蛋白的可行性。方法采用蛋白抽提试剂破菌方法抽提包涵体蛋白,初步纯化后在变性条件下用组氨酸标签结合树脂进行亲和层析,以透析方法复性,对纯化样品进行聚丙烯酰胺凝胶电泳及免疫印迹法、肽质量指纹谱鉴定。结果EOLA1蛋白在大肠杆菌中的表达主要以包涵体形式存在,初步纯化的包涵体中蛋白纯度>75%,亲和层析纯化后获得的蛋白纯度高达90%以上,肽质量指纹谱分析目的蛋白与理论蛋白肽段覆盖率较高。结论所应用的EOLA1蛋白纯化和复性方法简便有效,能够获得足量的高纯度EOLA1蛋白,有助于下一步制备EOLA1单克隆抗体及对相关基因进行功能研究。
- 蔡震梁自文罗向东杨宗城孙荣距苏踊跃
- 关键词：蛋白质复性纯化
- 抑制ECV304细胞内EOLA1基因表达后效应观察被引量：4
- 2007年
- 目的观察抑制人脐静脉内皮细胞系ECV304细胞内内皮高表达脂多糖相关因子1（endothe-lial-overexpressed lipopolysaccharide-associated factor 1,EOLA1）基因表达后细胞生长的变化。方法构建EGFP-EOLA1融合蛋白表达载体pEGFP-N2/EOLA1,转染ECV304细胞,G418压力筛选获得稳定表达株;设计靶点特异性的寡核苷酸,连接到经BamHⅠ和HindⅢ酶切线性化的pSlincer3.1/H1质粒上。转染重组质粒到稳定表达EGFP-EOLA1融合蛋白的ECV304细胞,检测靶基因的抑制情况,观察EOLA1表达被抑制后细胞生长的改变。结果抑制EOLA1表达后ECV304细胞生长明显减慢。结论EOLA1基因在细胞内参与了细胞生长的调控。
- 梁自文杨宗城陈建罗小凤王兴明
- 关键词：ECV304细胞细胞生长
- 人内皮高表达脂多糖相关因子1蛋白亚细胞定位研究被引量：1
- 2010年
- 目的 了解人内皮高表达脂多糖相关因子1（EOLA1）蛋白在内皮细胞中的亚细胞定位情况.方法 体外培养人脐静脉内皮细胞株ECV304,另构建增强型绿色荧光蛋白（EGFP）-EOLA1融合蛋白表达质粒.用脂质体分别将空质粒pEGFP-N2和融合蛋白表达质粒EGFP-EOLA1转染入ECV304细胞.继续培养48 h,取细胞,用蛋白质印迹法鉴定EGFP及EGFP-EOLA1融合蛋白的表达;采用激光共聚焦显微镜和免疫电镜技术,观察细胞中EOLA1蛋白的亚细胞定位情况.结果 经酶切和测序鉴定证实重组质粒EGFP-EOLA1构建成功.蛋白质印迹法检测结果显示,EGFP和EGFPEOLA1融合蛋白在转染细胞中成功表达.激光共聚焦显微镜下见转染空质粒的ECV304,绿色荧光遍布整个细胞,但无细胞核聚集现象;转染融合蛋白表达质粒的ECV304,绿色荧光也呈全细胞分布,且在胞核内明显聚集.透射电镜下见转染空质粒的细胞内无免疫沉积物,转染融合蛋白表达质粒的细胞质基质中有免疫沉积物.结论 EOLA1蛋白定位在ECV304细胞核与细胞质基质中,作为信号转导因子发挥作用.
- 罗敏梁自文杨宗城罗向东
- 关键词：内皮细胞显微镜检查转染亚细胞定位
- 人内皮活化相关新基因eola1的原核表达及鉴定被引量：1
- 2004年
- 目的 获得内皮高表达脂多糖相关因子 1(eola1)表达蛋白并对其进行分析鉴定。方法 采用反转录聚合酶链反应 (RT PCR)的方法从人ECV 3 0 4细胞中扩增出eola1基因开放阅读框 ,构建重组质粒 ,测序鉴定后转化大肠杆菌 ,IPTG诱导表达 ,裂解细菌抽提蛋白 ,目的蛋白进行聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS PAGE)、Western免疫印迹鉴定。结果 测序鉴定eola1开放阅读框成功插入PET 46 EK LIC质粒 ;重组质粒在大肠杆菌中成功表达人eola1蛋白 ,主要以包涵体形式存在 ,聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS PAGE)测定其分子质量约 2 0× 10 3,Westernblot验证出目的蛋白特异表达。结论 应用原核表达系统能够成功获得目的蛋白 ,为下一步制备eola1单克隆抗体及基因功能研究打下基础。
- 蔡震梁自文罗向东杨宗城孙荣距
- 关键词：原核表达重组质粒包涵体
- eola1下调表达对ECV304细胞增殖的影响被引量：2
- 2004年
- 目的 设计和构建人类新基因人内皮高表达脂多糖相关因子 1(endothelium overexpressedlipopolysaccharide as sociatedfactor1,eola1)特异性的小干扰RNA表达载体sieola1,建立eola1下调表达模型 ,观察eola1下调表达对细胞增殖的影响。方法 设计靶点特异性的寡核苷酸 ,连接到经BamHⅠ HindⅢ酶切线性化的pSlincer3 .1 H1质粒上 ;转染重组质粒到ECV3 0 4细胞 ,通过定量RT PCR实验检测靶基因的抑制情况 ;对转染sieola1质粒的细胞进行细胞计数 ,并应用流式细胞仪观察细胞周期的变化。结果 构建的小RNA干扰质粒sieola1转染ECV3 0 4细胞能够抑制靶基因eola1的表达 ;细胞计数和流式细胞仪检测结果显示eola1表达抑制后 ,细胞生长周期延长。结论 成功构建了针对eola1基因的siRNA质粒 ;细胞计数和流式细胞仪检测结果初步确认eola1具有抑制ECV3 0 4细胞增殖的作用。
- 刘月明杨宗城梁自文苏踊跃罗向东陈渝梁光萍陈建
- 关键词：RNA干扰ECV304EOLA1转染
