国家自然科学基金(20776060)
- 作品数：8 被引量：42H指数：4
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- 相关领域：生物学轻工技术与工程医药卫生更多>>
- 羰基还原酶与甲酸脱氢酶偶联催化制备(R)-苯基乙二醇被引量：2
- 2009年
- 以重组菌E.coli Rosetta/pETDuet-rcr-fdh全细胞为催化剂,2-羟基苯乙酮和甲酸钠为双底物,研究了生物催化反应体系中温度、pH值、底物2-羟基苯乙酮的初始浓度、反应时间、细胞浓度和状态等对产物(R)-苯基乙二醇生成效率的影响规律.结果表明,在温度35℃和pH7.0、底物初始浓度6g/L、时间36h、湿细胞浓度10%(ω)的条件下,产物的光学纯度高达98.37%e.e.,得率达79.14%.在上述反应体系中添加5mmol/LZnSO4后,重组菌催化的不对称还原反应效率显著提高,产物(R)-苯基乙二醇光学纯度达到100%e.e.,得率高达86.3%.
- 张荣珍徐岩耿亚维王珊珊孙莹
- 关键词：重组大肠杆菌生物催化光学纯度
- 一种新型(S)-羰基还原酶的克隆及其功能表达被引量：6
- 2010年
- 【目的】从近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis CCTCC M203011)基因组中钓取新型(S)-羰基还原酶基因(scrⅡ),对其生物转化手性醇的功能进行了验证。【方法】采用PCR的方法,从C.parapsilosis基因组中扩增出一段可能的羰基还原酶基因scrⅡ。以构建的重组菌Escherichia coli BL21/pET28a-scrⅡ为生物催化剂,2-羟基苯乙酮为底物进行催化反应,经HPLC分析,计算终产物的光学纯度和产率,确定了转化反应的最适温度和pH值。【结果】scrⅡ基因全长为840bp,编码279个氨基酸,与已报道的(S)-羰基还原酶基因scr的一致性为85%。氨基酸序列分析表明SCRⅡ具有典型短链醇脱氢酶的功能域:辅酶结合区域Thr40-Gly41-(X)3-Gly45-X-Gly47和催化三联体结构Ser172-(X)n-Tyr187-(X)3-Lys191。在30℃,0.1mmol/LIPTG的诱导下,(S)-羰基还原酶(SCRⅡ)在E.coli中过量表达。以10%(w/v)的重组菌为催化剂,高浓度(6g/L)2-羟基苯乙酮为底物,在最适反应温度35℃和pH5.5的条件下,转化产物(S)-苯基乙二醇的光学纯度高达99.1%e.e.,产率为89.6%。与(S)-羰基还原酶SCR相比较,底物浓度提高了一倍,产物的光学纯度和产率分别提高了10%和28%。【结论】采用分子克隆技术分离出新型羰基还原酶SCRⅡ的编码基因,该酶的发现为手性醇的高效制备奠定了坚实的研究基础。
- 耿亚维张荣珍王珊珊徐岩
- 关键词：基因克隆生物转化
- 热压法提取高温大豆粕中的大豆蛋白被引量：14
- 2009年
- 采用热压法(温度121℃、0.1MPa)提取高温大豆粕中蛋白。结果表明,pH8.0提取条件下,高温大豆粕经过加热处理后,其蛋白溶出率为49.60%,比普通的碱溶酸沉方法提高了39.14%,但仍低于白豆片的溶出率(白豆片的溶出率为65%)。通过正交实验,优化的提取工艺条件为:料水比为1∶30(g:mL),pH为10.0,热水处理时间20min,此条件下高温大豆粕中蛋白的溶出率可达到59.03%。示差扫描量热仪(DSC)和聚丙酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)表明,高温大豆粕经热处理后所得提取物为完全变性的蛋白聚集体,由此方法制得的蛋白具有较好的溶解性和乳化活性。
- 郑田要杨晓泉
- 关键词：热压法分离蛋白溶解性乳化活性
- (R)-专一性羰基还原酶与甲酸脱氢酶基因在大肠杆菌中的共表达被引量：6
- 2008年
- 【目的】通过研究(R)-专一性羰基还原酶和甲酸脱氢酶基因在大肠杆菌中的共表达,解决较高底物浓度下不对称转化反应的辅酶限制性问题。【方法】分别以近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis CCTCC M203011)和博伊丁假丝酵母(Candida boidinii)基因组为模板,采用PCR方法扩增得到(R)-专一性羰基还原酶基因(rcr)和甲酸脱氢酶基因(fdh),克隆到共表达载体pETDuet^(TM)-1中进行表达。共表达质粒pETDuet-rcr-fdh转化稀有密码子优化型菌株E.coli Rosetta,获得重组菌E.coli Rosetta/pETDuet-rcr-fdh。【结果】在30℃条件下,经1 mmol/L IPTG诱导表达8 h后,SDS-PAGE结果表明(R)-专一性羰基还原酶和甲酸脱氢酶均有明显的表达,其相对分子质量分别为37 kDa和40 kDa。以高浓度(6 g/L)2-羟基苯乙酮为底物时,0.1 g重组菌细胞催化产生(R)-苯基乙二醇,产物光学纯度为100%e.e.,产率为85.9%。与无甲酸脱氢酶参与辅酶再生循环的重组菌E.coli Rosetta/pETDuet-rcr相比,产物光学纯度和产率分别提高了1.3和2.7倍。【讨论】该重组菌的构建为基因工程法生物合成(R)-苯基乙二醇的工业应用奠定了基础。
- 孙莹张荣珍徐岩
- 关键词：羰基还原酶甲酸脱氢酶共表达辅酶再生
- (R)与(S)-羰基还原酶偶联一步法制备(S)-苯乙二醇被引量：2
- 2009年
- 【目的】通过(R)-和(S)-羰基还原酶在大肠杆菌中偶联,实现了一步法制备(S)-苯乙二醇的生物转化过程。【方法】将来源于近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis CCTCC M203011)的(R)-羰基还原酶基因(rcr)和(S)-羰基还原酶基因(scr)串联于共表达载体pETDuetTM-1上。重组质粒pETDuet-rcr-scr转化稀有密码子优化型菌株Escherichia coli Rosetta,获得酶偶联重组菌株E.coli Rosetta/pETDuet-rcr-scr。当重组菌体培养至OD6000.6～0.8时,添加终浓度1mmol/L IPTG,30℃诱导蛋白表达10h。【结果】SDS-PAGE结果表明(R)-和(S)-羰基还原酶均明显表达,它们的相对分子质量分别为37kDa和30kDa。重组菌生物转化结果表明:在pH7.0的磷酸缓冲液中,添加5mmol/L Zn2+时,获得产物(S)-苯乙二醇,产物光学纯度为91.3%e.e.,产率为75.9%。【讨论】采用分子重组技术成功整合了两种氧化还原酶的催化功能,实现了(S)-苯乙二醇的一步法转化,为简化手性醇制备途径提供了一条崭新的思路。
- 张荣珍徐岩孙莹耿亚维
- 关键词：羰基还原酶生物转化
- 树脂原位吸附促进高浓度底物不对称氧化还原合成(S)-苯基乙二醇被引量：4
- 2008年
- 以近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)全细胞为催化剂,考察了添加吸附树脂对不对称氧化还原外消旋苯基乙二醇制备(S)-苯基乙二醇(S-PED)的影响。通过树脂吸附性能考察,筛选出一种对底物有较快吸附速率和较大吸附量的树脂NKAⅡ,在反应体系中加入一定量NKAⅡ树脂,可以显著降低底物和产物对反应过程的抑制,提高反应的初始底物浓度。结合树脂对底物的吸附量和菌体反应的最适底物浓度,建立了树脂添加量随底物浓度变化的关系式,通过此公式添加树脂将溶液中底物产物总浓度控制在最适水平,从而实现高初始浓度底物、快速度反应。在40 g/L初始底物浓度转化体系中加入0.74 g树脂,平衡2 h后,反应108 h,产物S-PED的ee值和产率分别为98.1%和88.5%,产物浓度达到35.4 g/L。
- 刘荣仕穆晓清徐岩聂尧
- 关键词：近平滑假丝酵母吸附树脂
- 蛋白质组学技术鉴定与分析三七粉诱导海兔神经连索表达的差异蛋白质被引量：4
- 2008年
- RP-HPLC分离三七粉提取液,并鉴定含有Rb1、Rg1、Re、R1等皂甙成分。以蓝斑背肛海兔(Notarcusleachii cirrosus Stimpson,NLCS)为分析模型,三七粉提取液为诱导剂,选用蛋白质组技术研究NLCS神经连索诱导前后所表达的差异蛋白质。通过优化双向凝胶电泳分离NLCS神经连索全蛋白质组技术,获得496个蛋白质斑点。采用肽指纹图谱技术和数据库检索比对法,初步鉴定了NLCS受三七粉提取液诱导前后,其神经连索表达13个差异蛋白质,其中较高的匹配率蛋白质为肌动蛋白、3-羟酯酰辅酶A脱氢酶、ATP结合转运子和甲基转移酶12。选用LOC tree软件对13个差异蛋白质进行亚细胞定位,认为它们在保护神经系统中发挥重要的调节作用。
- 冯丽剑黄琳卓慧钦黄河清
- 关键词：皂甙差异蛋白质蛋白质组技术
- 生物催化立体选择性氧化还原中存在问题及其发展策略被引量：8
- 2008年
- 以立体选择性氧化还原酶或其全细胞催化的不对称氧化还原反应已经成为转化光学活性手性醇及其他手性化合物的有效手段。然而,生物催化氧化还原反应体系存在着催化活性与专一性、反应体系与催化稳定性等生物催化剂所固有的局限性问题,而且,生物氧化还原反应必需辅酶及其再生问题也是限制该转化途径产业化应用的一个重要因素。围绕上述生物催化立体选择性氧化还原中存在的关键问题,现代分子生物技术及反应工程的不断突破和发展为改善生物催化立体选择性氧化还原在催化剂本身和反应工程方面的局限性提供了有效的发展策略,为其进一步大规模产业应用提供了发展基础。
- 聂尧徐岩
- 关键词：生物催化
