北京市自然科学基金(7032046)
- 作品数：10 被引量：25H指数：4
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- 维甲酸对人视网膜色素上皮细胞Cx43蛋白和mRNA表达的影响被引量：3
- 2011年
- 目的观察体外培养的人视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)细胞中缝隙连接蛋白(connexin43,Cx43)表达特点,以及药物维甲酸(retinoic acid,RA)对RPE细胞Cx43mRNA和蛋白表达的影响。方法取体外传代的第4代人RPE细胞,分为药物组、空白对照组和对照组。药物组分别用终浓度为0.1×10-6mmol·L-1、10-6mmol·L-1、10×10-6mmol·L-1的RA培养,对照组和空白对照组分别加入等体积的无水乙醇、培养液。用免疫组织化学法和原位杂交观察Cx43蛋白和mR-NA的表达情况;用Western blot和RT-PCR半定量法测定RA对体外培养人RPE细胞Cx43蛋白和mRNA表达的灰度值。结果免疫组织化学染色显示体外培养的人RPE细胞表达Cx43,表达的部位主要为细胞浆和细胞膜;Western blot半定量结果显示RA对人RPE细胞Cx43蛋白表达有明显的促进作用,3种浓度药物组灰度值分别是1.1167±0.0031、1.0240±0.0006、0.8560±0.0030;原位杂交定位显示Cx43mRNA主要表达在细胞核;RT-PCR半定量结果显示RA使RPE细胞的Cx43mRNA表达量明显增加,3种浓度药物组灰度值分别是1.3091±0.0053、1.1797±0.0009、0.8390±0.0042。结论体外培养的人RPE细胞表达Cx43;RA可上调Cx43蛋白和mRNA的表达,从而抑制细胞生长。
- 王凤翔何守志顾峥梁秋丽陈兵
- 关键词：维甲酸视网膜色素上皮细胞缝隙连接蛋白43
- 视网膜细胞间缝隙连接研究进展
- 2006年
- 视网膜各层及各种细胞均有丰富缝隙连接蛋白(connexin,Cx)的表达,不同的动物种类和不同的视网膜细胞可以表达不同的缝隙连接蛋白。胚胎期眼球和视网膜的生长发育、成年视网膜正常生理功能的形成等均与缝隙连接蛋白的表达密切相连,并且这些缝隙连接蛋白的表达和功能可以被外界环境所影响,从而达到调节视网膜功能的目的。
- 王凤翔何守志
- 关键词：视网膜细胞间隙
- 维甲酸对人RPE细胞胞间通讯功能和Cx43表达的影响被引量：5
- 2006年
- 目的观察培养的人视网膜色素上皮(RPE)细胞中连接蛋白Cx43的表达特点,以及维甲酸(RA)对人RPE细胞生长和细胞间缝隙连接功能、细胞间通道蛋白Cx43表达的影响及其相互关系。方法免疫组织化学方法观察缝隙连接蛋白(Cx43)在培养的人RPE细胞中的表达特点;不同浓度的RA作用于培养的第4代人的色素上皮细胞,用MTT方法观察RA对体外培养人RPE细胞生长的抑制;用LY染料传输方法测定细胞间隙连接功能,观察这三组不同浓度的RA对人RPE细胞缝隙连接功能的影响;免疫组织化学方法鉴别不同浓度RA影响后的缝隙连接蛋白Cx43的表达,用计算机灰度测量的方法评估表达的强度并作统计学分析。结果免疫组织化学染色显示体外培养的人RPE细胞表达缝隙连接蛋白Cx43,表达的部位主要在细胞浆和细胞膜上;RA对人RPE细胞的生长有明显的抑制作用,其抑制作用呈剂量依赖性;LY染料传输试验表明在RA的作用下RPE细胞间通讯功能明显增强;经计算机图像分析表明RA使连接蛋白Cx43表达增强,增强的程度与RA的浓度呈正相关。结论体外培养的人RPE细胞可以表达Cx43蛋白,RA抑制培养的色素上皮细胞的生长,提高细胞间隙连接通讯功能,上调Cx43蛋白在人RPE细胞中的表达。
- 王凤翔何守志顾峥宋欣陈兵
- 关键词：缝隙连接蛋白视网膜色素上皮CX43蛋白
- 大鼠视网膜细胞间隙连接蛋白Cx43的表达被引量：3
- 2007年
- 目的:探讨细胞间隙连接蛋白connexin43(Cx43)在BN大鼠视网膜中的分布特点。方法:以雄性挪威棕色大鼠(Brown Norway)为研究对象,应用免疫组化方法观察Cx43在BN大鼠视网膜中的分布特点。结果:正常视网膜内界膜,视神经纤维层以及神经节细胞层明显表达,神经节细胞表达的主要位置是细胞质和细胞膜,色素上皮细胞全层表达,内外颗粒层及内外层状层无表达。结论:正常视网膜的Cx43主要分布在内界膜,神经纤维层,视网膜节细胞层和视网膜色素上皮层。
- 梁秋丽王凤翔何守志史雪辉陈兵
- 关键词：BN大鼠视网膜连接蛋白CX43
- 小干扰RNA对人视网膜色素上皮细胞缝隙连接蛋白43表达水平的调节被引量：6
- 2008年
- 目的观察体外化学合成的小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)对原代培养的人视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)细胞缝隙连接蛋白43(connexin43,cx43)基因和蛋白表达的影响。方法设计合成针对人cx43基因的小干扰片段(siR-NA1、siRNA2、siRNA3)和1条阴性对照siRNA0,在脂质体的介导下转染培养的人RPE细胞,采用RT-PCR确定最有效的抑制片段;针对siRNA的有效片段,分为不同浓度(50～30nmol.L-1)转染培养细胞,培养72h后进行MTT增生试验,观察其对人RPE细胞增生能力的影响,确定最有效的浓度;siRNA转染细胞后,分别培养12h、24h、48h、72h后进行Westonblot试验,观察不同时间点其对cx43蛋白表达的影响。结果体外合成的3条siRNA均在一定程度上抑制cx43基因的合成,其中siRNA1是最有效的抑制片段,根据条带灰度比其抑制率达到72%;siRNA1可以显著促进人RPE细胞的增生,增生率达到146%;明显抑制其cx43蛋白的表达(P<0.01),抑制率达到61%;从浓度组间结果可以看出,siRNA的最佳作用浓度是250nmol.L-1,在此浓度之前效率与浓度呈正比,超过此浓度后各浓度组间差异无统计学意义;比较不同时间点,siRNA转染人RPE细胞24h后开始抑制cx43表达,48h后对cx43蛋白合成抑制率最明显。结论化学合成的siRNA可以有效抑制培养的人RPE细胞cx43基因的表达,促进细胞的增生,这种基因沉默作用可能对于视网膜色素上皮组织的再生有一定作用。
- 司艳芳王凤翔何守志吕杨张娟美黄倩香
- 关键词：小干扰RNA视网膜色素上皮细胞缝隙连接蛋白43
- EGF对人视网膜色素上皮细胞胞间通讯功能和Cx43表达的影响被引量：7
- 2005年
- 目的探讨培养的人视网膜色素上皮(retinalpigmentepithelium,RPE)细胞中连接蛋白Cx43的表达,以及表皮生长因子(epidermalgrowthfactor,EGF)对人视网膜色素上皮细胞间缝隙连接功能、细胞间通道蛋白Cx43表达的影响。方法免疫组化的方法观察Cx43在培养的人RPE细胞中的表达特点,用10mg·L-1、20mg·L-1、30mg·L-1不同浓度的EGF作用于培养的第4代人RPE细胞后,观察缝隙连接蛋白Cx43的表达强弱变化,用计算机灰度测量的方法评估表达的强度并作统计学分析。用LY染料传输方法测定细胞间隙连接功能,观察这3组不同浓度的EGF对人RPE细胞缝隙连接功能的影响。结果免疫组化染色显示体外培养的人RPE细胞表达缝隙连接蛋白Cx43,经计算机图像分析表明EGF使连接蛋白Cx43表达减弱,下调的程度与EGF的浓度呈正相关。LY染料传输试验显示在EGF作用下视网膜色素上皮细胞间通讯功能明显降低。结论体外培养的人RPE细胞表达Cx43,EGF可以减弱细胞间隙连接通讯功能、下调Cx43在人RPE细胞中的表达。
- 王凤翔何守志顾峥陈兵
- 关键词：连接蛋白视网膜色素上皮细胞CX43
- siRNA作用后培养的人视网膜色素上皮细胞蛋白质谱分析
- 2009年
- 目的通过抑制人视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)细胞缝隙连接蛋白43(connexin 43,cx43)基因的表达,寻找差异蛋白,初步探讨cx43基因对RPE细胞生命活动的意义。方法提取细胞总蛋白并定量分析,第一向电泳是用pH3～10线性IPG预制胶条进行等电聚焦,第二向电泳是用SDS-PAGE凝胶再分离蛋白。银染PAGE凝胶、干燥,Powerlook 2100XL扫描凝胶。利用Image Master 2D Elite 4.01图像分析软件进行分析,蛋白斑点相对分子质量和等电点采用二维校正法确定。随机选取图像分析中siRNA转染组与RPE细胞对照组凝胶图中volume值相差≥2倍的7个蛋白质斑点进行胶内酶切,经胶上原位酶切和质谱分析得到肽质量指纹图谱,查寻蛋白质数据库并鉴定差异蛋白质,分析其生物学意义。结果RPE细胞对照组3块凝胶共分离出蛋白质斑点861个,组间匹配率达到92%;siRNA转染组3块凝胶共分离出蛋白质斑点887个,组间匹配率达到93%。经过软件图像分析,发现volume值相差≥2倍的点共78个,其中上调的16个,下调的18个。有19个点在RPE细胞对照组存在而siRNA转染组不存在,25个在siRNA转染组存在而RPE细胞对照组不存在。随机选取7个点进行蛋白质谱分析:SP-H抗原、P27BBP、有丝分裂活性蛋白激酶、次黄嘌呤核苷酸脱氢酶和热休克蛋白70表达上调,β-actin表达下降,电压依赖阴离子通道蛋白在转染siRNA后出现表达。结论通过蛋白质谱发现cx43基因沉默后引起多种蛋白的表达失调,cx43可能参与RPE细胞的多种生命活动。
- 司艳芳何守志王凤翔
- 关键词：连接蛋白43RNA干扰蛋白质组学
- 激光损伤对BN大鼠视网膜缝隙连接蛋白Cx43分布的影响被引量：3
- 2005年
- 目的 探讨细胞间隙连接蛋白(connexin 4 3,Cx4 3)在(BrownNorway ,BN)大鼠视网膜中的分布特点以及氪激光损伤视网膜后Cx4 3分布的变化。方法 应用雄性BN为研究对象,氪红激光眼底光凝(波长6 4 7nm ,能量36 0mW ,光斑直径5 0 μm ,曝光0 .0 5s)。右眼视盘周围10个激光点。光凝后1周开始取材,应用免疫组化方法观察Cx4 3在BN大鼠视网膜中的分布特点。结果 正常视网膜内界膜、视神经纤维层以及神经节细胞层明显表达,神经节细胞表达的主要位置是细胞浆和细胞膜,色素上皮细胞全层表达,内外颗粒层及内外丛状层无表达。激光损伤后的内界膜,视神经纤维层以及神经节细胞层Cx4 3表达明显减少,瘢痕区视网膜色素上皮细胞接近消失,而激光斑周边色素上皮细胞表达不受影响,激光斑部位增殖的成纤维样细胞部分表达。结论 正常视网膜的Cx4 3主要分布在内界膜、神经纤维层、视网膜节细胞层和视网膜色素上皮层,激光损伤后内界膜、视神经纤维层以及神经节细胞层表达减弱,激光斑周围色素上皮细胞中表达无明显变化。
- 王凤翔何守志史雪辉陈兵
- 关键词：BN大鼠视网膜连接蛋白
- 特异siRNA沉默人RPE细胞cx43基因的生物学变化
- 2009年
- 目的通过RNA干扰的方法沉默缝隙连接蛋白43(connexin43,cx43),观察cx43对人视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)细胞活动的影响。方法培养原代的人RPE细胞,以不同浓度转染针对人cx43基因的小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)特异片段,通过流式细胞仪观察其对细胞周期的影响;通过扫描电镜观察其对细胞形态的影响;采用激光共聚焦和荧光淬灭恢复技术观察荧光恢复速率平均百分率,评价其对细胞间通讯功能的影响;通过制作RPE细胞损伤模型,观察其对损伤修复能力的作用。结果培养24h和48h,流式细胞仪检测S期RPE细胞比率,对照组分别为:(8.85±1.33)%和(15.52±2.60)%;100nmol.L-1、200nmol.L-1、300nmol.L-1siRNA1转染RPE细胞后,24h、48hS期细胞比率分别为:(10.64±2.50)%、(20.98±5.78)%,(19.42±2.88)%、(32.67±4.31)%,(20.31±4.03)%、(27.59±6.95)%,S期细胞比率明显增多,与对照组相比差异均有统计学意义(P均<0.05)。细胞的扫描电镜显示转染siRNA后,细胞表型发生变化,细胞体积增大,表面触手增多。cx43基因被干扰后,细胞荧光恢复速率降低,细胞间通讯功能明显降低;细胞损伤修复能力下降。结论cx43正常表达不仅影响细胞间通讯功能,且对细胞的生长周期、损伤修复多种细胞行为也起着重要作用。
- 司艳芳王凤翔何守志
- 关键词：小干扰RNA视网膜色素上皮细胞缝隙连接蛋白43
- 表皮生长因子对人视网膜色素上皮细胞Cx43mRNA表达的影响被引量：4
- 2006年
- 目的:观察表皮生长因子(epidermalgrowthfactor,EGF)对培养的人视网膜色素上皮(retinapigmentepitheliumcell,RPE)细胞中缝隙连接蛋白Cx43蛋白及mRNA的表达影响。方法:不同浓度的EGF作用于培养的第4代人的RPE细胞24h,采用Westernblot的方法测定Cx43的蛋白;原位杂交观察Cx43mRNA在RPE细胞中的表达特点;RT-PCR实验对EGF影响后的RPE细胞的mRNA进行半定量观察。结果:Westernblot试验证实不同浓度的EGF均可使Cx43蛋白表达量明显减少,并且与EGF的浓度呈正相关,原位杂交显示所有细胞均表达Cx43mRNA,其表达部位主要在细胞质和核;RT-PCR实验对mRNA进行半定量观察显示表皮生长因子使RPE细胞的mRNA表达量明显减少。结论:EGF可以下调Cx43蛋白及Cx43mRNA在人RPE细胞中的表达。
- 王凤翔何守志顾峥梁秋丽陈兵
- 关键词：表皮生长因子色素上皮细胞CX43
