国家自然科学基金(20676053)
- 作品数：19 被引量：60H指数：5
- 相关作者：饶志明方慧英诸葛健沈微诸葛斌更多>>
- 相关机构：江南大学教育部浙江经贸职业技术学院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金国家高技术研究发展计划长江学者和创新团队发展计划更多>>
- 相关领域：生物学轻工技术与工程化学工程环境科学与工程更多>>
- 菌株Bacillus sp ST06-95转化植物甾醇为雄甾烯酮发酵条件的优化被引量：3
- 2008年
- 利用本研究室筛选获得的Bacillus sp ST06-95为出发菌株,对植物甾醇进行选择性侧链降解制备雄甾-4-烯-3,17-二酮(AD)和雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮(ADD)。对转化条件如底物浓度、投料方法、投料时间进行了摸索,对发酵初始pH、转化时间、发酵温度、接种量、培养基组成等进行了优化。结果表明,用0.4%的Tween80配合超声波溶解、底物浓度为0.5%、菌体未生长时投加底物转化效果最佳。最佳发酵条件为:初始pH7.0、接种量12%、发酵温度30℃、发酵时间160h,发酵培养基中甘油与葡萄糖的含量为1∶4。在最佳转化条件下产物ADD与AD的得率从优化前的29.5%提高到42.5%,其中ADD与AD的含量比值大约为4∶1。
- 廖伟宏饶志明沈微方慧英诸葛健
- 关键词：植物甾醇微生物转化17-二酮17-二酮
- 利用荧光蛋白研究产甘油假丝酵母胞浆3-磷酸甘油脱氢酶基因CgGPD启动子被引量：7
- 2008年
- 【目的】克隆产甘油假丝酵母(Candida glycerinogenes)胞浆3-磷酸甘油脱氢酶基因CgGPD的启动子(PCggpd),并通过报告基因gfp的差异表达来研究葡萄糖浓度对PCggpd在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中的诱导特性。【方法】采用PCR扩增的方法分别从产甘油假丝酵母基因组和pCAMBIA1302载体中克隆出CgGPD的启动序列PCggpd和绿色荧光蛋白基因gfp。将两个基因同时构建到酿酒酵母表达载体pYX212-zeocin中,构建时将绿色荧光蛋白基因gfp置于CgGPD的启动序列下游,获得重组质粒pYX212-zeocin-PCggpd-gfp。通过电击转化酿酒酵母W303-1A。将重组酿酒酵母S.cerevisiae W303-1A-GFP置于不同葡萄糖浓度培养基中进行培养,利用荧光显微技术对其进行荧光检测。【结果】重组酿酒酵母能产生稳定的荧光,当葡萄糖浓度为2%时,重组酿酒酵母在YEPD培养基中产生较弱的荧光,随着葡萄糖浓度的升高,荧光强度有明显的增强。【结论】PCggpd属于环境胁迫诱导型启动子,高浓度的葡萄糖能诱导PCggpd启动绿色荧光蛋白的高水平表达,这对完善产甘油假丝酵母的遗传背景研究,阐明其高产甘油的机理具有重要意义。
- 丁春生饶志明诸葛斌沈微陈献忠方慧英诸葛健
- 关键词：产甘油假丝酵母
- 高效液相色谱-质谱联用法分析微生物降解植物甾醇为雄甾烯酮被引量：1
- 2008年
- 采用高效液相色谱-质谱联用法(HPLC/MS)分析测定植物甾醇侧链降解过程中产物雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮(ADD)及雄甾4-烯-3,17-二酮(AD)。其中液相色谱的条件为色谱柱AlltimaC18ODS-2(5μm,250mm×4.6mm);流动相甲醇:水(V/V=7:3);流速1mL/min;柱温室温;紫外检测器的检测波长244nm。质谱为ZMD Micromass电喷雾质谱仪。结果测得ADD与AD标准样品的保留时间分别为9.70min与11.13min,发酵样品的HPLC与MS图谱与ADD与AD标准样品的图谱一致。采用高效液相色谱法定量ADD与AD的线性范围在0.01mg/mL^0.09mg/mL,产物回收率分别为102.6%与105.90%,日内精密度分别为3.02%与3.08%,日间RSD分别为3.50%与3.24%。该方法灵敏度高、选择性好、操作简便、定量准确,适用植物甾醇微生物侧链降解过程中产物的分析及产品质量控制。
- 沈微廖伟宏饶志明方慧英诸葛健
- 关键词：植物甾醇17-二酮液质联用
- 一株转化4-羟基-2-丁酮为1,3-丁二醇微生物菌株的筛选及鉴定
- 2009年
- 从本实验室保藏的86株酵母菌株中筛选到20株利用4-羟基-2-丁酮(4H2B)生产1,3-丁二醇(1,3-BDO)的菌株,当转化液中4H2B浓度为10g/L时,经初步测定1,3-BDO含量,其中菌株32 1,3-BDO产量最高达6.5g/L,具有较好的1,3-BDO生产潜力。对其进行形态学和常规生理生化鉴定实验,并结合18S rDNA基因分析,比对结果表明,菌株32与Pichia farinosa strain DC 3343相似性达99.8%,为Pichia farinosa的一个亚种。
- 杨套伟饶志明马正徐美娟周楠迪许正宏
- 关键词：1,3-丁二醇
- 一株高效转化Phytosterol为雄甾烯酮菌株的筛选与鉴定被引量：1
- 2009年
- 从保藏的200多株菌中筛选出1株高效转化植物甾醇为4-烯-雄甾-3,17-二酮和1,4-二烯-雄甾-3,17-二酮的菌株,并对该菌进行了形态、生理生化的研究。结果发现菌株ST06可以利用多种碳源,可以水解淀粉,但不利用纤微素。用16SrDNA的方法对其进行鉴定,发现与Bacillus属Bacillus amyloiquefaciens的相似性最高,达到99.9%,将该菌株命名为Bacillus amyloiquefaciens ST06。该菌在培养温度30℃,pH7.0,转速220r/min,转化时间7d,底物添加量为0.3%时,ADD与AD的总得率高达40%以上,此时底物转化率高达93.7%。
- 夏海锋饶志明廖伟宏徐美娟许正宏
- 关键词：植物甾醇芽胞杆菌微生物转化17-二酮17-二酮
- 一步法产1,3-丙二醇酿酒酵母基因工程菌的构建被引量：8
- 2007年
- 1,3-丙二醇(1,3-PD)是一种重要的化工原料,发酵法生产1,3-PD是一条新颖且具有潜在竞争力的生产途径。本研究在前期工作的基础上,将分别来源于大肠杆菌和肺炎克雷伯氏菌的基因片段yqhD和dhaB串联表达,构建重组表达载体pYX212-zeocin-pGAP-yqhD-pGAP-dhaB;并得到重组酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)W303-1A/pYX212-zeocin-pGAP-yqhD-pGAP-dhaB。该重组菌和对照S.cerevisiae分别以葡萄糖为底物摇瓶发酵72h后,重组酿酒酵母发酵液中1,3-PD含量约为1.5g/L;而对照菌株不产1,3-PD。以上结果表明本研究在国内首次成功构建了直接以葡萄糖为底物发酵生产1,3-PD的酿酒酵母基因工程菌。为进一步将dhaB、yqhD基因导入其他以葡萄糖为底物高产甘油的酵母宿主中表达,获得以葡萄糖为底物一步法发酵高产1,3-丙二醇工程菌打下了坚实的基础。
- 马正饶志明沈微方慧英诸葛健
- 关键词：1,3-丙二醇
- 产甘油假丝酵母与酿酒酵母胞浆3-磷酸甘油脱氢酶基因的功能比较被引量：5
- 2009年
- 胞浆3-磷酸甘油脱氢酶(GPD)是酿酒酵母细胞甘油合成过程中的关键限速酶.尽管高产甘油菌株产甘油假丝酵母基因组中编码该酶的基因CgGPD已经被克隆出来,但是具体的功能,特别是与酿酒酵母GPD1和GPD2基因的功能比较值得进一步研究.以酿酒酵母渗透压敏感型的gpd1/gpd2和gpd1突变株为宿主,分别导入CgGPD、GPD1和GPD2基因,比较分析了CgGPD、GPD1和GPD2基因在高渗透压胁迫条件下和厌氧环境中的表达调控,及其对细胞甘油合成能力的影响.研究发现,GPD1基因受到渗透压诱导表达,GPD2基因在细胞厌氧条件下起着氧化还原平衡调节作用,而CgGPD基因不仅能够在渗透压胁迫条件下通过过量快速合成甘油调节渗透压平衡,而且能够在厌氧培养环境中互补GPD2基因的缺失,使gpd1/gpd2缺失突变株能够正常生长,同时提高了突变株的甘油合成能力.结果表明,CgGPD基因在gpd1/gpd2缺失突变株中既具有GPD1基因的功能,又能发挥GPD2基因的功能.
- 陈献忠方慧英饶志明沈微诸葛斌王正祥诸葛健
- 关键词：产甘油假丝酵母3-磷酸甘油脱氢酶甘油合成渗透压调节
- 产甘油假丝酵母甘油合成关键酶编码基因的克隆被引量：4
- 2008年
- 产甘油假丝酵母(Candida glycerinogenes)作为优良的甘油生产菌株已经成功应用于工业化生产。但相对于酿酒酵母,该菌株的耐高渗机理和甘油代谢的分子机制还不甚清楚。本文根据已公布的3-磷酸甘油脱氢酶基因的序列信息,设计出一组寡核苷酸,再运用简并PCR结合反向PCR技术从C.glycerinogenes的基因组DNA中获得了4900 bp的核苷酸序列,递交GenBank(No.EU186536)。该序列包含完整的编码胞浆3-磷酸甘油脱氢酶编码基因(CgGPD)开放阅读框及其上、下游调控序列。1167bp的开放阅读框编码388个氨基酸残基的蛋白。所演绎出氨基酸序列分析比对结果表明该基因产物的序列具有典型的胞浆3-磷酸甘油脱氢酶结构特征,但与已鉴定的相关基因存在中等程度的同源性并在相应的辅酶催化位点和底物结合位点区域具有高度的保守性,在氨基酸水平上与安格斯毕赤酵母的相似性最高,达到70.9%。该基因在Saccharomy cescerevisiae W303A中异源表达能够显著提高细胞的甘油合成能力。
- 陈献忠方慧英沈微饶志明诸葛斌王正祥诸葛健
- 关键词：产甘油假丝酵母3-磷酸甘油脱氢酶基因克隆甘油合成
- 国产弱阳离子琼脂糖交换介质的性能及其用于蛋清溶菌酶的分离纯化被引量：1
- 2009年
- 从理化性能、离子交换容量、静态和动态吸附性能等方面对国产快流速CM-琼脂糖弱酸性阳离子交换介质进行了综合考察和评价,并应用该介质进行了鸡蛋清中溶菌酶的分离。结果发现,国产介质的理化性能符合要求,离子交换容量达到了187 mmol/mL,高于国外商品介质;对模型蛋白溶菌酶的静态和动态吸附容量分别达到了107.0 mg/mL和90.3 mg/mL(高流速下),同样略高于国外商品介质,显示能够满足蛋白质的有效吸附;离子交换层析分离蛋清溶菌酶较为成功,纯度在95%以上,产量达到了4.1 mg/mL鸡蛋清。
- 夏海锋金雄华饶志明郝飞严伟郑志永
- 关键词：溶菌酶分离纯化
- 新一代高产甘油重组菌的构建及其初步发酵
- 2009年
- 产甘油假丝酵母(Candida glycerinogenes WL2002-5)是一株发酵生产甘油的工业化菌株。为进一步提高其产甘油能力,本研究利用前期研究中成功克隆的产甘油假丝酵母中甘油合成关键酶3-磷酸甘油脱氢酶基因CgGPD1,构建根癌农杆菌双元载体pCAM3300-zeocin-CgGPD1后,电击转化根癌农杆菌LBA4404,通过根癌农杆菌介导法(ATMT)转化产甘油假丝酵母,构建了产甘油假丝酵母重组菌。并从中筛选出一株酶活力和产甘油性能较好的产甘油假丝酵母重组菌株C.g-G8。以葡萄糖为底物摇瓶发酵96h后,重组菌C.g-G8的甘油产量比野生型菌株Candida glycerinogene提高18.06%,平均耗糖速率提高12.97%,平均酶活力提高27.55%。本研究成功利用ATMT法转化产甘油假丝酵母构建新一代高产甘油菌株。
- 刘爱玲饶志明马正诸葛斌方慧英诸葛健
- 关键词：产甘油假丝酵母根癌农杆菌介导转化
