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鸡Mx基因的表达及其抗血清的制备被引量：5: 2009年; Mx蛋白已被证明具有抗A型流感病毒、Thogoto病毒和水泡性口膜炎病毒等的生物活性。本研究通过PCR扩增,将Mx基因克隆至pMD18-T载体;经测序验证后将Mx基因克隆到原核表达载体pProExHTa和pcDNA3.1中。以构建的重组质粒pProExHTa-Mx转化大肠杆菌BL21,进行诱导表达,以切胶纯化方式回收了Mx融合蛋白,加佐剂乳化,免疫新西兰白兔制备抗血清;SDS-PAGE和western blot分析表明:Mx基因在大肠杆菌中以融合蛋白形式稳定表达,表达产物的相对分子量约80 ku,与预期值相符;抗血清能与Mx蛋白发生特异性反应。以真核表达重组质粒pcDNA3.1-Mx转染293T细胞,间接免疫荧光试验结果表明:原核表达蛋白免疫动物制备的抗血清与真核表达的Mx蛋白发生良好的免疫反应,表明用原核表达的Mx蛋白具有真核表达Mx蛋白相似的免疫学活性。抗血清的制备为鸡Mx蛋白的功能研究、Mx蛋白在转基因动物机体中表达的检测奠定了基础。; 谭复善李文超崔雷刘丹秦红刚孟庆文; 关键词：MX基因原核表达抗血清

靶向pol基因siRNA抑制J亚型禽白血病病毒复制的研究被引量：2: 2011年; 为筛选能够有效抑制J亚型禽白血病病毒(ALV-J)复制的siRNA,本研究根据ALV的pol基因保守序列设计合成5对shRNA序列,并将其分别克隆至pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR载体中,构建siRNA表达重组质粒,分别为pcDNA-sh-pol711、pcDNA-sh-pol814、pcDNA-sh-pol1016、pcDNA-sh-pol1915和pcDNA-sh-pol2516。将重组质粒分别转染DF-1细胞6h后,以100TCID50的ALV-J感染细胞,并利用IFA、westernblot和real-timePCR方法评价其对ALV-J复制的抑制效果。IFA和westernblot检测结果表明:其中pcDNA-sh-pol711、pcDNA-sh-pol814和pcDNA-sh-pol2516可以有效抑制病毒囊膜蛋白的表达。Real-timePCR结果显示:与阴性对照和空载体对照相比,这3种siRNA在mRNA水平对ALV-J的抑制率达29%～86%。本研究在细胞水平上筛选的siRNAs可作为候选siRNAs,为抗鸡ALV-J的研究奠定基础。; 张在平马学恩杨海彦田进孟庆文; 关键词：禽白血病病毒 SIRNA

Real-time RT-PCR检测J亚群禽白血病病毒的研究被引量：1: 2010年; 为了建立检测J亚群禽白血病病毒(ALV-J)的方法,试验采用Real-time RT-PCR,通过1对ALV-J特异性引物对ALV-J山东分离株(命名为ALV-JSD株)进行特异性、敏感性和重复性试验;然后用ALV-JSD株感染1日龄SPF鸡,感染8周后剖检取各组织,用已建立的方法检测ALV-LSD株的感染情况。结果表明:特异性试验中只有以ALV-JSD株cDNA为模板的反应管中能够检测到扩增曲线;敏感性试验测得反应灵敏度达到3.01×1010 copies/μL,比普通PCR灵敏100多倍;对人工感染鸡的不同组织样品进行3次重复检测,病毒检出率为100%;经重复性和实际临床样本检验证实,该方法稳定、可靠,为ALV-J的早期快速诊断建立了特异、灵敏、廉价的定量检测方法。; 张在平田进孟庆文马学恩; 关键词：J亚群禽白血病病毒 SYBR REAL-TIME RT-PCR

荧光定量PCR方法检测禽白血病病毒的研究被引量：4: 2009年; 根据禽白血病病毒各亚群pol基因序列相对保守的特点,在其保守区内设计了1对引物,进行RT-PCR反应,扩增产物为214 bp,将该产物连接T载体作为Real-time PCR反应的标准品,利用SYBR Green I染料进行Real-time PCR反应,建立了标准曲线,并进行反应灵敏性、特异性和重复性试验。试验结果表明:标准曲线线性关系R值均为0.999以上,检测极限约为8.21E+01拷贝数质粒DNA,比RT-PCR灵敏100倍以上;特异性分析表明只有禽白血病病毒能检测到特异性的熔解度峰值;批内和批间重复性试验的变异系数均小于5%;用已建立的方法对人工感染SPF鸡的不同组织进行3次重复检测,病毒RNA的检出率为100%。以上结果表明:该方法稳定可靠,为禽白血病的早期诊断建立了特异、灵敏和快捷的方法。; 张在平孟庆文马学恩; 关键词：禽白血病荧光定量PCR

表达靶向禽流感病毒多靶点miRNA重组慢病毒的制备及病毒感染效率检测被引量：1: 2010年; 慢病毒介导的RNAi具有转移基因效率高,作用持久稳定等特点,成为基因治疗和基因功能研究的重要工具。本试验中将在细胞水平验证可以抑制禽流感病毒(AIV)PA、NP和PB2基因表达的miRNA克隆到pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR载体,构建多靶点miRNA表达载体(pcDNA6.2/PA+NP+PB2);鉴定正确后通过BP/LR重组反应将GFP和靶向AIV串联miRNA转座到慢病毒表达载体pLenti6/DEST,命名为pLenti6/PA+NP+PB2;鉴定正确后与辅助包装质粒共转染293FT,72h收集细胞上清进行病毒浓缩;采用梯度稀释法和real-timePCR法测定病毒滴度;通过感染MDCK细胞、CEF细胞及猪胎儿成纤维细胞,评价重组慢病毒的感染效率。结果,酶切和测序表明pcDNA6.2/PA+NP+PB2和pLenti6/PA+NP+PB2构建成功;浓缩后梯度稀释法检测病毒滴度为4×107TU/mL,real-timePCR法检测病毒滴度为1×108TU/mL;病毒感染MDCK细胞和猪胎儿成纤维细胞的感染效率显著高于CEF细胞的感染效率。结果表明,我们成功制备了表达靶向AIV多靶点miRNA重组慢病毒,并发现以VSVG替代了env囊膜后慢病毒对CEF细胞敏感性较低,为进一步研究AIV的防控和慢病毒介导的抗AIV转基因动物模型奠定了基础。; 田进张在平孟庆文谭复善崔雷; 关键词：RNAI 多靶点慢病毒

靶向pol基因miRNA抑制禽白血病病毒复制的研究: 本研究比较分析了国内外已公布的禽白血病病毒不同亚群pol基因核苷酸序列,根据pol基因序列相对保守的特点及RNA干扰设计原则,设计了5对miRNA序列,合成后将其定向克隆到pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR真...; 张在平马学恩杨海彦田进孟庆文; 关键词：禽白血病病毒 MIRNA; 文献传递

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