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用羟基磷灰石纳米粒作内耳基因治疗新载体的体内外研究被引量：16: 2008年; 目的研制羟基磷灰石（hydroxyapatite，HAT）纳米粒，评价其作为新的内耳基因转染载体的可能性。方法用化学共沉淀-水热合成法制备HAT载体。经DNA电泳做不同pH值和HAT含量的DNA结合实验，了解HAT纳米粒对DNA的结合和保护作用；用四甲基偶氮唑盐法观察HAT纳米粒对宫颈癌上皮Hela细胞的毒性；用Hela细胞和小鼠耳蜗原代螺旋神经节细胞做神经营养素3（neurotrophin 3，NB）体外转染实验（绿色荧光蛋白基因荧光显微镜法）及NB的蛋白印迹分析，观察HAT介导的NB基因对活细胞的体外转染能力和基因表达情况；经实验性兴奋性耳毒性损伤豚鼠的耳蜗外淋巴腔灌注HAT纳米载体-含增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein，EGFP）质粒载体-NT3基因复合物（HAT—pEGFPC2-NT3），用免疫组化（二氨基联苯胺法）观察NT3在耳蜗的表达，以了解HAT纳米载体在活体动物耳蜗介导基因转染的能力。结果含量250．0μg／ml，pH值3～7是这种长约40～50nm的短棒状HAT纳米粒能完全结合重组质粒pEGFPC2-NT3的最低含量混悬液和最佳pH环境，并可有效保护基因不被核酸酶（DNase Ⅰ）破坏。四甲基偶氮唑盐法观察HAT纳米粒从62．5μg／ml至500．0μg／ml4种混悬液对Hela细胞存活率无明显影响，细胞形态无变化。EGFP荧光显微镜观察显示，HAT纳米载体对Hela细胞的基因转染率为15．7％±2．6％（-↑x±s）；将HAT—pEGFPC2-NT3转染培养的小鼠耳蜗神经元，也可见明显的EGFP表达。NT3免疫组化显示，向实验性兴奋性耳蜗损害豚鼠的耳蜗外淋巴腔灌注HAT—pEGFPC2-NT3，可见活体耳蜗神经元内有明显的NT3蛋白表达。结论HAT纳米粒不仅可介导NT3基因的体外转染，而且可介导其耳蜗活体转染；尽管转染率有待提高，但由于没有病毒载体转染造成的生物威胁，仍不失为一种很有研究价值的非病毒型内耳基因治疗载体; 孙虹蒋明朱晒红; 关键词：基因疗法药物载体羟基磷灰石类耳蜗

腺病毒载体-人神经营养素3基因治疗豚鼠耳蜗神经元损伤被引量：5: 2006年; 目的在建立卡因酸(kainic acid,KA)致豚鼠耳蜗兴奋性传入神经元损伤动物模型的基础上,观察腺病毒载体携带的人神经营养素-3(neurotrophin-3,NT-3)基因在豚鼠耳蜗内的表达及对豚鼠耳蜗KA损伤后传入神经元的保护作用。方法20只健康白毛红目豚鼠随机分成3组。第1组(6只):经右耳蜗鼓阶一次性灌注KA(4 mmol/L,10μl),建立耳蜗兴奋性损伤动物模型,7 d后再经右鼓阶灌注腺病毒载体-人神经营养素3基因复合物(pAdeasy-NT3)10μl作为实验组(Ad-NT3组)。第2组(7只):经右耳鼓阶灌注KA(4 mmol/L,10μl)作为实验对照组(KA组)。第3组(7只):不做耳蜗灌注,作为空白对照组(Blank组)。Ad-NT3组和KA组均于KA处理后第20天处死,观察Ⅰ型螺旋神经节细胞(传入神经元)的形态变化;空白对照组经相同的存活期后处死,观察Ⅰ型螺旋神经节细胞形态,作为正常对照。结果Ad-NT3组灌注pAdeasy-NT3后第13天,应用免疫组化法可检测到耳蜗内NT-3表达明显,其强度大于KA组;而且Ad-NT 3组耳蜗螺旋神经节细胞减少的数量低于KA组(P<0.001)。结论①豚鼠耳蜗兴奋性损伤后第7天局部应用重组腺病毒pAdeasy-NT3仍可减轻KA对耳蜗螺旋神经节细胞的损伤。②对基因治疗而言,在KA造成螺旋神经节细胞不可逆损伤之前有一段宝贵的治疗时机。; 潘曦孙虹; 关键词：神经营养素-3 腺病毒耳蜗神经

酶消化及差速贴壁法原代培养新生C57小鼠耳蜗膜蜗管外侧壁成纤维细胞被引量：1: 2010年; 背景:目前对耳蜗膜蜗管外侧壁成纤维细胞的培养没有特定的方法。目的:采用酶消化与差速贴壁相结合的方法,原代培养新生C57小鼠膜蜗管外侧壁成纤维细胞,提供良好的体外细胞模型。方法:显微解剖分离新生C57小鼠膜蜗管外侧壁组织,对膜蜗管外侧壁组织进行胰蛋白酶消化与差速贴壁相结合的方法培养成纤维细胞,倒置相差显微镜下观察细胞生长状态,苏木精-伊红染色,绘制细胞生长曲线,免疫组织化学染色鉴别细胞来源。结果与结论:膜蜗管外侧壁组织来源传代纯化的成纤维细胞呈梭形和三角形,生长曲线成S形,免疫组织化学检测波形蛋白,细胞胞浆中呈棕黄色阳性反应。结果证实培养出小鼠膜蜗管外侧壁成纤维细胞。; 王庭阔孙虹; 关键词：血迷路屏障原代培养小鼠成纤维细胞

新生C57小鼠耳蜗螺旋神经节细胞的原代培养被引量：1: 2010年; 背景:目前在原代细胞培养领域内,对耳蜗螺旋神经节细胞培养条件的报道各有差异,个别方法重复性较差,不利于实际应用。目的:原代培养并鉴定新生C57小鼠螺旋神经节细胞。方法:显微解剖分离新生C57小鼠蜗轴组织,经胰酶消化+差速贴壁+化学药物相结合方法培养;倒置相差显微镜及苏木精-伊红染色观察细胞生长状态,免疫组织化学染色鉴别细胞来源。结果与结论:蜗轴组织细胞纯化后,胞体呈椭圆形或三角形,有细长的突起,Nuen染色胞核呈棕黄色阳性反应,β3-Tubulin染色细胞胞浆与轴突均呈棕黄色阳性反应。提示实验成功培养出小鼠螺旋神经节细胞。; 王庭阔孙虹; 关键词：螺旋神经节细胞细胞模型原代培养小鼠耳蜗

含人神经营养素-3的重组腺病毒的高效制备: 2006年; 目的采用改良的细菌内同源重组法快速高效构建含人神经营养素-3(neurotrophin-3,NT-3)的重组腺病毒,为其用于神经性聋的在体研究做准备。方法将人全长NT-3基因亚克隆至带绿色荧光蛋白(greenflu-orescent protein,GFP)的穿梭质粒pshuttle-IRES-hrGFP-1上,用电穿孔法使线性化的重组穿梭质粒与预转入腺病毒骨架pAdeasy-1的大肠杆菌BJ5183-AD-1同源重组,脂质体法转染AD293细胞并大量扩增、柱层析纯化得到重组腺病毒pAdeasy-NT-3,GFP测定病毒滴度。结果PCR检测证明人NT-3已整合入腺病毒基因组并表达;Western blot证实在感染重组腺病毒pAdeasy-NT-3的Hela细胞中有相应NT-3蛋白表达;病毒滴度分别为pAdeasy-NT-3109U/ml、pAdeasy-hrGFP1010U/ml。结论利用新型的腺病毒载体Adeasy XL系统可以快速构建同时表达GFP和NT-3的重组复制缺陷型腺病毒pAdeasy-NT-3,柱层析纯化法能制备高纯度的病毒。; 潘曦孙虹; 关键词：神经营养素-3 腺病毒

神经营养素-3对豚鼠耳蜗传入神经元兴奋毒性损伤的保护作用被引量：8: 2005年; 目的观察谷氨酸(glutamate,Glu)致豚鼠耳蜗Ⅰ型螺旋神经节细胞兴奋毒性损伤后,耳蜗局部应用神经营养素-3(neurotrophin-3,NT-3)对Ⅰ型螺旋神经节细胞的保护作用及对复合动作电位(CAP)反应阈的影响。方法28只豚鼠左耳安置圆窗电极检测CAP的变化。然后分为NT-3组(实验组5只)、Glu组(实验对照组8只)、Hank’s液组(HBSS组)(正常对照组5只)、Blank组(空白对照组10只),前三组分别在药物灌注术后1天及4周测CAP反应阈,术后4周处死,Blank组术后1天测CAP反应阈后处死,观察Ⅰ型螺旋神经节细胞和神经纤维的显微和超微结构变化。结果NT-3组、Glu组术后1天CAP反应阈明显增高,NT-3组术后4周CAP反应阈明显降低,与HBSS组及Blank组比较均有显著性差异(P<0.01);术后4周NT-3组Ⅰ型螺旋神经节细胞数目的减少幅度明显小于Glu组(P<0.01),NT-3组与HBSS组和Blank组相比细胞数有显著差异(P<0.01)。HBSS组与Blank组相比,细胞数、CAP反应阈和组织学改变均无显著差异(P>0.05)。结论经外淋巴腔灌注谷氨酸能导致豚鼠耳蜗CAP反应阈提高和Ⅰ型螺旋神经节细胞死亡。耳蜗兴奋性损伤发生后60分钟,局部应用NT-3(15μgml)可减轻谷氨酸对耳蜗螺旋神经节细胞兴奋性毒性损伤,提示NT-3可用于神经性耳聋的治疗。; 张永全蒋明孙虹; 关键词：神经营养素-3 谷氨酸螺旋神经节耳蜗

羟基磷灰石纳米颗粒介导NT-3基因对豚鼠兴奋毒性损伤耳蜗的保护作用被引量：16: 2007年; 目的:利用羟基磷灰石纳米颗粒(hydroxyapatite nanoparticle,HAT)携带构建的神经营养因子-3(neurotrophic factor-3,NT-3)-绿色荧光蛋白基因(enhancement type Green fluorescent protein C2,pEGFPC2),通过耳蜗灌注方法转染兴奋毒性损伤后的豚鼠耳蜗螺旋神经节细胞(spinal ganglion cells,SGCs),观察pEGFPC2-NT3的表达及其对耳蜗螺旋神经节细胞的保护作用。方法:构建携带绿色荧光蛋白报告基因的重组质粒pEGFPC2-NT3。通过耳蜗灌注海人酸(kainic acid,KA)建立豚鼠耳蜗兴奋性损伤模型,在给KA1周后利用HAT携带重组质粒进行耳蜗灌注以转染耳蜗螺旋神经节细胞,免疫组化法观察转染后1周NT-3的表达及4周后电镜下螺旋神经节细胞形态学变化,同时观察对听觉脑干诱发电位(auditory brain-stem response,ABR)的影响。结果:成功构建豚鼠耳蜗兴奋损伤模型。灌注重组质粒后1周免疫组化法观察到螺旋神经节细胞胞浆内NT-3蛋白表达。4周后电镜下螺旋神经节细胞形态学损害减轻,ABR检测听功能较兴奋毒性损害后有恢复。结论:在豚鼠耳蜗灌注KA造成耳蜗兴奋性损伤后第7天,经耳蜗鼓阶转染羟基磷灰石纳米颗粒介导的NT-3基因仍可减轻KA对耳蜗螺旋神经节细胞的兴奋性毒性损伤。; 蒋明张永全贺广湘孙虹; 关键词：耳蜗神经营养因子-3 基因治疗

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国家自然科学基金(30371531)

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