国家自然科学基金(30371598)
- 作品数：7 被引量：21H指数：3
- 相关作者：葛海良李美星张惠珍王颖王树军更多>>
- 相关机构：上海第二医科大学上海交通大学更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金上海市高等学校科学技术发展基金更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- TIL识别的HLA-A2限制性人黑色素瘤特异抗原肽的研究
- 2005年
- 目的探讨TIL识别的人黑色素瘤HLA-A2限制性的肿瘤抗原肽特性。方法通过亲和层析柱从三种肿瘤细胞系(624-Mel、Chap-Mel和JY)中纯化HLA-A2蛋白和结合的多肽分子,经弱酸高温处理和离心超滤后,应用反相-高效液相色谱层析(RT-HPLC)分离各多肽组份,并将其各组份与T2细胞共同孵育、进行重建TIL识别的人黑色素瘤特异表位试验,鉴定肽分子生物活性,通过质谱分析所获活性肽分子特性,参照活性肽序列,制备人工合成肽加以进一步证实。结果从RT-HPLC层析的624-Mel的肽组份,经特异表位鉴定发现3个活性峰(P19、P25和P31)。其中P31,TIL杀伤率达67%,质谱分析表明肽分子量为948,氨基酸序列为H+Ala Lue Trp Lue Phe Phe Gly Val Lue OH-的9肽分子。经特异表位测定表明人工合成肽具有纯化活性肽的生物活性特征。结论分离鉴定的这一9肽分子是一种TIL识别的HLA-A2限制性肿瘤抗原肽,为肿瘤防治、合成肽疫苗的研究奠定了可靠的实验基础。
- 葛海良李美星金姝陈影张勇
- 关键词：TILHLA-A2限制性肿瘤抗原肽疫苗
- 新的肿瘤相关抗原(OVA66)的研制和临床初步应用被引量：2
- 2005年
- 目的 制备OVA6 6蛋白和其抗体,探讨其检测肿瘤的应用价值。方法 应用原核表达技术和Ni2 + 亲和层析法,制备纯化的OVA6 6蛋白,经SDS- PAGE电泳鉴定,将纯化蛋白加佐剂免疫家兔,获得抗OVA6 6蛋白抗血清,并应用WesternBlot测定其滴度和特异性。利用OVA6 6蛋白和其抗体分别建立ELISA和免疫组化法,测定正常人和肿瘤患者的血清OVA6 6抗体水平和肿瘤组织标本中OVA6 6蛋白表达量。结果 获得的高纯度OVA6 6蛋白和高滴度、特异性抗OVA6 6抗血清。ELISA检测显示,正常人和肿瘤患者血清抗体水平存在显著性差异(P <0 .0 0 1)。正常人组OD均值为0 . 2 0±0 0 5 ,肿瘤患者组OD均值为0 . 36±0. 12 ,肿瘤患者中阳性率为4 0 % (46 / 116 )。免疫组化法结果表明,肿瘤组织标本阳性率达81% (34/ 4 2 ) ,而正常组织均为阴性。结论 应用OVA6 6蛋白和其抗血清建立的检测方法,为临床肿瘤辅助诊断的应用奠定基础。
- 杨振熙李美星尤强陈影张惠珍葛海良
- 关键词：肿瘤相关抗原ELISA
- 探讨高表达肿瘤抗原基因OVA66对WISH细胞生物学特征的影响被引量：1
- 2007年
- 目的分析转染OVA66基因WISH细胞的生物学特征变化,探讨该基因的功能。方法采用脂质体方法将重组真核表达载体pcDNA3.1-OVA66转染正常人羊膜细胞系WISH,经G418稳定筛选、克隆和扩增。采用RT-PCR、Western blotting和免疫荧光等方法检测目的基因及其蛋白的表达,通过电镜分析细胞超微结构,体外侵袭实验检测细胞生长特性和侵袭能力,软琼脂克隆形成实验检测细胞的克隆性生长能力,并应用基因芯片技术检测相关基因差异表达。结果RT-PCR检测显示,转染pcDNA3.1-OVA66细胞OVA66基因呈高表达;Western bloting显示OVA66蛋白处出现明显的条带;电镜检测表明该基因可明显增强WISH细胞增殖能力;体外侵袭实验显示,该基因可增强WISH细胞的侵袭转移能力;软琼脂克隆形成实验表明OVA66基因可以促进单克隆性生长能力;基因芯片提示,该基因高表达影响某些基因的异常表达。结论提示OVA66基因高表达可促进细胞的增殖,利于肿瘤的侵袭和转移。
- 汤军桥李美星王树军张惠珍王颖张勇葛海良
- 关键词：OVA66肿瘤相关基因基因芯片
- 干扰OVA66基因表达对移植瘤生物学功能的影响被引量：2
- 2008年
- 目的探讨干扰OVA66基因表达对移植瘤细胞生物学功能的影响。方法采用脂质体法,以重组的pSUPER-shRNA-OVA66和空载体转染HeLa细胞获得稳定表达细胞株,经RT-PCR和Western blot鉴定OVA66基因的表达。将两组细胞接种于BALB/cnu/nu裸鼠的前肢腋下,连续观察干扰OVA66表达对肿瘤的生长影响。并于接种4周后,应用RT-PCR,免疫组化、免疫荧光等方法检测移植瘤细胞中OVA66的蛋白表达。组织病理分析肿瘤细胞生长和转移的特征。结果经检测pSUPER-shRNA-OVA66能有效抑制目的基因的表达。比较两组荷瘤小鼠中肿瘤的生长曲线发现,OVA66实验组的肿瘤生长速度明显低于对照组,并且肿瘤细胞体内转移和浸润能力显著降低。结论干扰OVA66基因和蛋白表达,可以抑制肿瘤细胞的生长,浸润和侵袭能力。
- 钱呈睿张惠珍李美星王树军王颖葛海良
- 关键词：RNA干扰肿瘤生物学行为
- 肿瘤抗原基因OVA66对肿瘤细胞生物学特征的影响被引量：10
- 2006年
- 目的:探讨肿瘤抗原基因OVA66对肿瘤细胞生物学特征的影响。方法:采用脂质体法,以重组真核表达载体pcDNA3.1-OVA66转染肝癌细胞系SMMC-7721,经G418稳定筛选、克隆及扩增,采用RT-PCR、Westernblot和免疫细胞化学(ICC)染色法,检测目的基因及其蛋白的表达。用FACS检测细胞周期的变化;电镜技术观察细胞的超微结构;体外运动、侵袭实验检测细胞运动及侵袭能力;并应用基因芯片技术检测相关基因的差异表达。结果:RT-PCR检测显示,转染pcDNA3.1-OVA66的细胞中OVA66基因呈高表达。Westernblot显示,在OVA66蛋白处出现明显的条带。电镜和FACS检测表明,该基因可增强肿瘤细胞的增殖能力。体外运动、侵袭实验证实,该基因可促进肿瘤细胞的迁移、侵袭。基因芯片显示,该基因的高表达可促进Ⅰ型纤溶酶原激活物抑制剂(PAI-1)等基因的表达,影响肿瘤的侵袭和转移。结论:OVA66基因及其蛋白可促进肿瘤细胞的增殖、侵袭、转移等一系列生物学功能。
- 李美星王树军王颖张惠珍尤强周光炎葛海良
- 关键词：OVA66肿瘤相关基因基因芯片
- CTL识别的HLA-A2限制性人卵巢癌相关抗原OVA66表位的鉴定被引量：11
- 2005年
- 目的: 鉴定CTL识别的HLA A2限制性人卵巢癌相关抗原OVA66表位。方法: 以细胞因子从外周血单个核细胞(PBMC)中诱导树突状细胞(DC), 通过形态学观察和流式细胞术进行鉴定。用表位预测法选取并合成两种肽分子, 分别脉冲成熟的DC, 并刺激HLA- A2+健康人自体CD8+ T细胞。1wk后, 用脉冲肽的自体PBMC以每 7d的间隔刺激该CD8+T细胞 3次。以共接受 4次抗原肽刺激的T细胞作为CTL,用乳酸脱氢酶(LDH)释放试验, 检测CTL对靶细胞的杀伤效应。用酶联免疫斑点法 (ELISPOT), 检测CTL中抗原特异性分泌IFN- γ的T细胞数。结果: 形态学和流式细胞术的结果显示, PBMC可诱生成熟的DC。肽L235(FLPDHINIV)诱导的CTL, 可特异性杀伤L235脉冲的T2细胞和OVA66+、HLA A2+的SW480细胞, 且L235诱导的特异性分泌IFN- γ的T细胞数增加。结论: 卵巢癌相关抗原OVA66的HLA A2限制性CTL表位L235, 能激发对肿瘤抗原的特异性免疫应答, 为制备肿瘤特异性肽疫苗奠定了实验基础。
- 金姝王颖王树军张惠珍李美星陈影葛海良
- 关键词：表位CTLELISPOT
- 肿瘤相关抗原基因OVA66特异的RNA干扰对肿瘤细胞生物学特性的影响被引量：3
- 2005年
- 构建OVA66基因的特异小干扰RNA表达载体,转染HeLa细胞,分析对该基因表达和肿瘤生物学特性的影响。以RT-PCR、Westernblot方法检测OVA66基因在多种肿瘤细胞系的表达谱。利用计算机辅助设计和合成针对OVA66的特异小干扰RNA的DNA片段,定向克隆于特定的干扰载体(pSUPER)。利用脂质体法将重组载体转染于OVA66高表达细胞系HeLa,筛选得到shRNA-OVA66稳定表达细胞。采用Real-timePCR检测目的基因的表达;FACS、Westernblot方法分析目的蛋白的表达。MTT、3H-TdR掺入等方法检测干扰OVA66基因表达后对HeLa细胞增殖和凋亡的影响。双酶切鉴定得到针对OVA66基因特异的shRNA表达载体(pSUPER-shRNA-OVA66),并经序列分析证实。经检测pSUPER-shRNA-OVA66稳定表达的HeLa细胞(shRNA-OVA66)中目的基因mRNA水平降低;OVA66蛋白表达受到抑制,表明设计的靶片段对目的基因有显著的抑制效果。并显示shRNA-OVA66细胞DNA合成下降;细胞周期分析表明阻断OVA66基因表达可抑制shRNA-OVA66细胞增殖能力,并引发细胞凋亡。OVA66特异的shRNA表达载体构建成功,阻断OVA66基因表达可抑制细胞增殖,促使细胞凋亡,为OVA66蛋白肿瘤生物学功能与肿瘤发生、发展的研究奠定基础。
- 李美星王颖王树军张惠珍周光炎尤强葛海良
- 关键词：OVA66肿瘤相关基因
