国家自然科学基金(30671844)
- 作品数：7 被引量：15H指数：3
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- 不同变异位点的HIV-1 vpr重组真核表达载体对转染细胞凋亡作用的观察被引量：7
- 2009年
- 目的观察不同的人免疫缺陷病毒1型（HIV-1）的vpr基因变异株致宿主细胞凋亡作用的区别，及其可能的机制。方法14个带有不同变异位点的中国感染者HIV-1 vpr基因片断，其PCR产物纯化后经HindⅢ和BamHⅠ双酶切，以pcDNA3．1（＋）真核表达质粒连接转化实验，将重组质粒用脂质体瞬时转染至HeLa细胞，G418筛选后收获细胞。RT-PCR检测目的基因mRNA水平的表达，荧光染色在显微镜下观察Hoeschst凋亡细胞并计算凋亡率，DNA琼脂糖电泳观察各转染细胞凋亡条带，膜联蛋白V-FITC流式细胞检测各株细胞凋亡率，并比较各株细胞的半胱酸蛋白水解酶3活性差别。结果14个vpr基因片段转染HeLa细胞后，发现有第70、85、86或94位变异的vpr转染细胞Hoeschst染色凋亡率和半胱酸蛋白水解酶3活性检测（分别为0．1225，0．1675，0．1975，0．1575和11．356，8．021，14．6875，10．521）较无这些变异的保守序列vpr转染细胞（0．355和182．4875）为低，DNA琼脂糖电泳法和膜联蛋白细胞凋亡检测也提示同样的规律；第1～7号重组质粒（均为vpr AE亚型）的致细胞凋亡能力也明显小于第8～14号重组质粒（vpr B，AB，C和C／BC亚型）。结论首次观察到有第70、85、86或94位变异的HIV-1 vpr序列，其致HeLa细胞凋亡的能力低于无这些位点变异的保守序列，AE亚型诱导宿主细胞凋亡能力低于其他亚型，其机制之一与半胱酸蛋白水解酶3途径激活降低有关。
- 郑煜煌张春迎何艳龚国忠李慧谌资刘猛周华英李瑛刘纯李靖周国强尹伟袁宏丽
- 关键词：HIV-1凋亡
- 中国人类免疫缺陷病毒-1 vpr基因多态性及其临床意义被引量：6
- 2009年
- 目的分析来自中国不同地区HIV-1感染者的vpr基因序列变异位点及与国外以往研究的异同，为进一步研究HIV-1 vpr基因变异的意义及其与感染者临床病情的关系奠定基础。方法RT-PCR及套式PCR法对398例HIV-1感染者行HIV-1vpr基因扩增，并进行氨基酸序列分析，了解HIV vpr基因的多态性、离散率和常见变异位点。同时将发现常见变异位点感染者的相应病毒水平、淋巴细胞亚群及临床病程的进展进行对比分析。结果对398份血标本行HIV1 vpr基因扩增，分析后可用氨基酸序列为153份。HIV-1 Vpr氨基酸序列分型主要是CRF01_AE 51．63％，C亚型24．84％，B亚型17．65％，CRF03-AB 3．92％，CRF08_BC 1．31％。HIV Vpr序列中第77位氨基酸84．3％为谷氨酸，与以往国外报道的R77Q变异与AIDS长期病情无进展（LTNP）密切相关的观点有明显差异。HIV Vpr第、63、70、85、86、89、94位氨基酸的变异，有可能使感染者的临床进展趋缓。结论我国HIV Vpr分型仍以M组为主，其中CRF01_AE占优势。HIV-1 Vpr中氨基酸序列某些位点的变异可能与感染者临床表现相关。
- 李慧冯铁建郑煜煌王晓辉刘猛陈琳刘纯李瑛
- 关键词：人类免疫缺陷病毒基因VPR多态现象基因扩增
- 表达HIV Vpr细胞株的建立及其促细胞凋亡作用的研究被引量：5
- 2008年
- 目的建立稳定表达人免疫缺陷病毒（HIV）Vpr蛋白的细胞株，观察Vpr蛋白促进感染细胞凋亡的特性，以及Vpr变异后对其致凋亡作用的影响。方法以携带野生株HIV vpr基因和突变株HIV vpr—FS基因的质粒分别转染HeLa细胞，建立稳定表达HIV Vpr蛋白的细胞株，以流式细胞仪和细胞内DNA片段分析法检测细胞凋亡效果，观察Vpr蛋白促细胞凋亡的特性，以及两者致凋亡作用的区别。结果重组质粒pcDNA3．1-vpr和pcDNA3．1-vpr-FS经酶切后均可获得342bp产物，DNA测序结果与目的基因已知序列完全一致；上述质粒转染的HeLa细胞，RT-PCR检测到目的基因vpr或vpr-FS的表达，Western blot检测到明显Vpr或Vpr—FS蛋白的表达。流式细胞仪和细胞内DNA片段分析法分别检测细胞凋亡，显示野生株HeLa pcDNA3．1-vpr组的凋亡率明显高于对照组，而变异株HeLa pcDNA3．1-vpr-FS的凋亡率与对照组无明显差别。结论成功建立了表达HIV Vpr和HIV Vpr—FS蛋白的感染细胞株。实验显示HIV Vpr蛋白能促进感染细胞的凋亡，而Vpr蛋白的变异可能使其促进细胞凋亡作用减弱。实验结果为下一步研究提供了基础资料。
- 丁佩佩郑煜煌龚国忠谌资周华英张春迎刘猛刘纯袁宏丽李瑛李慧
- 关键词：人免疫缺陷病毒VPR基因凋亡
- HIV/AIDS患者抗病毒治疗后γ链细胞因子的变化及其意义被引量：2
- 2013年
- 目的观察γ链细胞因子在艾滋病病毒(HIV)感染者/艾滋病(AIDS)病人(HIV/AIDS病人)和正常人表达水平的区别,及其在24个月的高效抗反转录病毒治疗(HAART)治疗中的动态变化,分析其与抗病毒治疗的关系及其临床意义。方法 40名HIV/AIDS病人在初次HAART治疗的0、6、12、18和24个月进行回访,另35名正常人作为对照,均采集外周血,用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测常见的γ链细胞因子[白细胞介素2、4、7、15、21(IL-2、IL-4、IL-7、IL-15、IL-21)和γ干扰素(IFN-γ)],同时使用流式细胞计数法测定CD4+T和CD8+T淋巴细胞数量,实时反转录聚合酶链反应(RT-PCR)法测定血清中HIV核糖核酸(RNA)水平。结果未经抗病毒治疗的HIV/AIDS病人外周血IL-2、IL-15、IL-21和IFN-γ水平显著低于正常人,而IL-4和IL-7水平显著高于正常人。在启动HAART后的各次回访中,随着外周血HIV RNA病毒载量水平和CD8+T淋巴细胞数量的逐渐下降和CD4+T淋巴细胞数量的显著增加,IL-2、IL-15、IL-21和IFN-γ水平也逐步上升,而IL-4和IL-7水平逐步下降,显示出一定的相关关系。结论这些常见的γ链细胞因子可能和HIV感染的致病机制相关,并可能参与了抗病毒免疫重建和病毒控制过程。
- 郑煜煌陈霞谌资周华英何艳加路贺波贺梅罗艳姚运海王红燕肖水灵林一鹤
- 关键词：艾滋病高效抗反转录病毒治疗白细胞介素Γ干扰素
- 中国HIV-1 vpr基因多态性及其进化树的分析
- 2010年
- 目的分析中国各地HIV-1感染者的vpr基因多态性，比较HIV-1 vpr基因变异的基本特征及其与国外以往研究的异同，为进一步探索HIV-1 vpr的致病机理及可能的基因治疗靶位打下基础。方法提取348例中国各地区HIV-1感染者血浆病毒RNA，运用逆转录聚合酶链式反应（RT—PCR）扩增HIV-1 vpr基因，凝胶电泳鉴定后行基因测序。用Blast、ClustalW、Mega4．0等相关生物分析软件进行vpr基因核苷酸和Vpr氨基酸序列分析，并构建进化树，分析中国HIV．1感染者的vpr基因的多态性、变异特征和亚型的分子流行病学特征。结果按vpr基因分型共发现AB、AE、BC、B、C5种HIV-1亚型，分别占2．60％，55．19％，2．60％，18．18％，21．43％，其中AE亚型比例最大。观察到Vpr氨基酸序列有9个变异率大于20％的位点。结论首次分析中国感染者的HIV-1vpr基因多态性及其基因进化树的特征，发现一些vpr变异率较大的氨基酸位点，这些Vpr氨基酸序列的变异与其致病能力的关系有待进一步研究。
- 刘猛郑煜煌何艳陈霞周华英张春迎谌资郑力文
- HIV-1 Vpr对细胞周期的影响和致凋亡作用的研究被引量：3
- 2009年
- 目的研究人免疫缺陷病毒1型（HIV-1）的vpr基因和不同变异株对宿主细胞周期和凋亡的影响，以及其致细胞周期变化和致细胞凋亡机制的两者间的可能关系。方法将14个带有不同变异位点的中国感染者HIV-1 vpr片段分别连入pcDNA3．1（＋）真核表达载体，构建重组质粒。将这些重组质粒电转染Jurkat细胞，并设立保守株vpr基因转染细胞、突变株vpr—Fs基因转染细胞、空载体转染细胞和未转染细胞作为对照。经G418选择培养及RT—PCR检测目的基因转染成功后，PI染色，流式细胞仪检测被转染细胞的细胞周期分布和细胞凋亡。结果流式细胞仪检测上述14个带有不同变异位点的HIV-1 vpr基因片段的Jurkat细胞，发现转染保守片段HIV-1 vpr的Jurkat细胞，其细胞周期出现G2期阻滞和细胞凋亡率明显升高，但转染vpr C端截断的vpr—Fs片段的细胞、空载体pcD-NA3．1（＋）转染细胞和未转染的Jurkat细胞无此现象。转染了HIV-1 vpr基因序列相对应的Vpr蛋白中含有70V、85P、86G、94G突变的片段，较vpr保守片段其致感染细胞G2期阻滞和凋亡的能力明显下降，且Vpr蛋白的AE亚型致细胞周期阻滞和致凋亡能力较其他亚型普遍为低。初步发现vpr诱导G2期阻滞百分比越高其所致凋亡率越高。结论HIV-1 vpr基因有明显的致感染细胞G2周期阻滞和致细胞凋亡的作用，但vpr C端截断的vpr—Fs片段无此功能。首次发现中国感染者HIV-1 vpr基因表达蛋白的70V、85P、86G、94G位点突变能使其致感染细胞G2期阻滞和凋亡的能力下降，Vpr的AE亚型致细胞周期阻滞和凋亡能力较其他亚型普遍为低。对14个变异片段的分析显示vpr诱导G2期阻滞的程度与其致凋亡水平可能相关，提示两者的发生机制可能有一定的关联。本研究为进一步探讨HIV-1致病机制和探索可能的基因干预措施打下基础。
- 刘纯郑煜煌周华英何艳蒋永芳张永红谌资刘猛陈霞郑力文
- 关键词：HIV-1VPR基因细胞周期细胞凋亡
- HIV Vpr蛋白与细胞凋亡的关系及其作用被引量：2
- 2006年
- vpr基因是HIV的辅助基因之一,编码一个96氨基酸的Vpr辅助蛋白。在病毒侵犯宿主细胞的过程中,Vpr蛋白发挥着重要的作用。它参与病毒整合前复合体的核转运,激活病毒的转录过程,诱导感染细胞周期的G2/M期停滞,促进感染细胞凋亡。这些生物活性提示Vpr能与感染细胞内的生化路径相互作用,调节HIV-1的复制和发病。Vpr有多种作用,其中促细胞凋亡活性受vpr基因变异位点的影响,如单个的L64P的变异就能显著增强其活性。Vpr部分或完全缺陷与感染者病程进展缓慢有关。Vpr主要通过线粒体及caspase途径诱导细胞凋亡,但目前Vpr在疾病的发病及进展过程的作用尚未完全弄清。本文主要讨论vpr基因在病毒感染过程中的作用,尤其是诱导细胞凋亡的作用以及对将来通过抑制vpr来抗病毒治疗的展望。
- 丁佩佩郑煜煌谌资刘猛刘纯
- 关键词：凋亡核转运基因
