国家自然科学基金(31072013)
- 作品数：5 被引量：32H指数：4
- 相关作者：罗军朱江江石恒波许会芬李君更多>>
- 相关机构：西北农林科技大学南京农业大学更多>>
- 发文基金：公益性行业(农业)科研专项国家自然科学基金转基因生物新品种培育专项更多>>
- 相关领域：农业科学生物学更多>>
- 西农萨能羊MAT基因的原核表达及多克隆抗体制备被引量：8
- 2014年
- 【目的】制备高特异性、高效价的乙酰/丙二酸单酰转移酶(MAT)多克隆抗体,为研究山羊MAT在脂肪酸代谢中的功能奠定基础。【方法】采用PCR方法扩增奶山羊的MAT基因,将其亚克隆到pET32a(+)载体得到pET32a(+)-MAT原核表达载体,并转化到大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达。使用Ni-NTA琼脂糖亲和层析柱纯化融合蛋白,纯化的MAT蛋白经复性后进行活性检测。采用皮下免疫法将纯化的MAT蛋白免疫兔子制备多克隆抗体,用ELISA和Western blot检测血清多克隆抗体的效价和特异性。【结果】PCR扩增得到981bp的MAT基因编码区;成功构建了pET32a(+)-MAT原核表达载体,诱导表达获得了56ku的重组蛋白。活性检测表明,复性后的MAT具有转移酶活性,ELISA检测显示抗体效价达1∶128 000,经Western blot鉴定,制备的多克隆抗体能特异性检测原核表达的MAT蛋白以及在HEK-293细胞中表达的MAT蛋白。【结论】获得了具有酶活性的MAT蛋白以及高特异性、高效价的兔抗MAT多克隆抗体,为研究MAT在脂肪酸代谢中的功能提供了重要的试验工具。
- 李芳罗军许会芬石恒波朱江江
- 关键词：原核表达多克隆抗体
- 山羊脂肪酸合酶基因(FASN)启动子结构与功能的初步分析被引量：6
- 2012年
- 本研究旨在对山羊脂肪酸合酶基因(Fatty acid synthase,FASN)启动子进行结构与功能的初步分析,进而对其转录调控机制进行探讨。采用PCR技术从西农萨能羊基因组DNA中克隆FASN基因启动子,通过缺失分析,构建7个包含不同缺失片段的荧光素酶报告基因载体,转染山羊乳腺上皮细胞和MCF-7细胞,利用双荧光素酶系统检测不同片段的启动活性。结果表明,克隆得到FASN基因的启动调控序列2 589bp,生物信息学分析发现,该启动子序列含有典型的启动转录元件TATA-box和E-box,分别位于转录起始位点(+1)上游-41和-74bp处。报告基因分析表明,启动子核心区域定位在-293～-79bp,在线软件预测发现,该区域含有Sp1、NF-Y、USF和SREBP等转录因子结合位点。结果显示,FASN基因启动子前端存在负调控元件,Sp1、NF-Y、USF和SREBP等转录因子可能参与FASN基因的转录调控。
- 李君葛婷罗军孙雨婷石恒波朱江江郝娟赵旺生
- 关键词：山羊脂肪酸合酶启动子山羊乳腺上皮细胞
- 腺病毒介导的山羊固醇调节元件结合蛋白-1基因的超表达对乳腺脂肪酸代谢相关基因表达的影响
- ＜正＞本研究旨在通过构建西农萨能羊固醇调节元件结合蛋白-1（SREBP-1）基因的重组腺病毒超表达载体,获得有感染性的病毒颗粒,并检测该基因过表达后对乳腺上皮细胞中脂肪酸代谢相关基因的影响,为进一步研究该基因在脂肪酸代谢...
- 许会芬罗军李芳石恒波李君林先滋朱江江
- 关键词：山羊SREBP-1超表达
- 文献传递
- 西农萨能羊乙酰/丙二酸单酰基转移酶基因重组腺病毒载体的构建被引量：2
- 2012年
- 本研究旨在通过构建西农萨能羊脂肪酸合酶(FASN)基因乙酰/丙二酸单酰基转移酶(MAT)区域的重组腺病毒载体,为研究其在奶山羊乳腺上皮细胞中过表达以及功能和作用机制做准备。根据GenBank收录的西农萨能羊MAT序列设计引物,PCR扩增并克隆测序。将目的基因连接到穿梭载体pAdTrack/CMV上并线性化后,转化含有腺病毒骨架载体pAdEasyⅠ的E.coli Bj5183感受态细胞进行同源重组,得到重组腺病毒质粒pAd-MAT-HIS,并用PacⅠ酶切鉴定,将经过PacⅠ线性化的pAd-MAT-HIS转染HEK 293细胞进行病毒包装和扩增,用LaSRT法测定病毒滴度。将本次克隆的MAT序列与GenBank收录的山羊序列对比发现,在601bp处碱基由G转变为A,导致氨基酸序列由丙氨酸(Ala)201转变为苏氨酸(Thr)201。酶切鉴定、绿色荧光蛋白观察、PCR及Western blot检测均证明,重组腺病毒质粒构建成功,病毒滴度为2×109 PFU.mL-1。本研究成功构建了重组腺病毒pAdEasy-MAT-HIS。
- 朱江江罗军王紫骞许会芬孙雨婷石恒波郝娟赵丽媛
- 关键词：奶山羊重组腺病毒
- 山羊SREBP-1基因的超表达对脂肪酸代谢相关基因表达的影响被引量：13
- 2012年
- 本研究旨在通过构建西农萨能羊固醇调节元件结合蛋白-1(SREBP-1)基因的重组腺病毒超表达载体,获得有感染性的病毒颗粒,并检测该基因过表达后对乳腺上皮细胞中脂肪酸代谢相关基因的影响,为进一步研究该基因在脂肪酸代谢及泌乳调控中的功能奠定基础。根据GenBank中收录的西农萨能羊SREBP-1基因的序列设计引物,PCR扩增后进行测序。将测序正确的目的基因连接到穿梭载体pAdTrack-CMV后并进行线性化,转化含有腺病毒骨架载体pAdEasy-1的大肠杆菌Escherichia coli BJ5183感受态细胞中进行同源重组,将重组成功的质粒进行PacⅠ酶线性化,转染HEK 293细胞进行重组腺病毒的包装、扩繁及滴度测定。病毒液感染原代乳腺上皮细胞,实时荧光定量检测SREBP-1超表达效果及对脂肪酸代谢相关基因的影响。结果表明:重组腺病毒质粒构建成功,腺病毒滴度为109U/mL。病毒液感染乳腺上皮细胞48 h后,SREBP-1基因表达量上升大约15倍,72 h后,表达量上调了30倍;对脂肪酸代谢相关基因的影响在72 h较为明显,其中,脂肪酸合酶(FASN)及酰基辅酶A羧化酶(ACC)均显著上调了大约两倍,过氧化物酶体增殖物激活受体(PPARγ)上调了大约1.5倍,肝素X受体(LXRα)及甘油三酯水解酶(ATGL)表达量升高了1.2倍;其中硬脂酰辅酶A去饱和酶(SCD)表达水平无明显变化。表明在西农萨能羊乳腺上皮细胞中,SREBP-1能够促进脂肪酸合成相关基因的表达,对山羊乳腺脂肪酸代谢具有调控作用。
- 许会芬罗军李芳余康石恒波李君林先滋朱江江
- 关键词：山羊SREBP-1超表达
- 奶山羊短链脂肪酸受体GPR43基因CDS区的克隆及组织表达分析
- 实验旨在克隆奶山羊短链脂肪酸受体GPR43(G protein-coupled receptor 43)并分析其组织表达谱,为进一步研究其在奶山羊中的功能提供实验基础。根据GenBank上已登录的牛(NM01163784...
- 孙雨婷罗军朱江江李君王慧吴敏
- 关键词：奶山羊克隆
- 文献传递
