国家高技术研究发展计划(2003AA215072)
- 作品数：6 被引量：16H指数：2
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- 相关机构：温州医学院成都军区无锡市第五人民医院更多>>
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- 多重耐药大肠杆菌耐药基因与整合子遗传标记基因间的相关性被引量：7
- 2011年
- 【目的】对多重耐药大肠埃希菌(Escherichia coli)临床株的β-内酰胺酶类(β-lactamases,BLs)和氨基糖苷钝化酶类(aminoglycoside modifying enzymes,AMEs)耐药基因与Ⅰ-Ⅲ类整合子遗传标记基因之间的相关性进行研究。【方法】采用VITEK-GNS药敏卡测定136株E.coli对14种抗菌素的敏感性;纸片扩散法确认超广谱β-内酰胺酶(extended-spectrum beta-lactamases,ESBLs)产酶株;PCR法检测BLs、AMEs相关耐药基因及Ⅰ-Ⅲ类整合子遗传标记基因;接合传递试验和质粒提取对16S rRNA甲基化酶基因进行初步定位。【结果】136株多重耐药的E.coli ESBLs产生率高达70.59%(96/136),产酶株对氨苄西林、庆大霉素、妥布霉素、亚胺培南和哌拉西林/他唑巴坦以外的其余9种抗菌素的耐药率显著高于非产酶株(P<0.05)。BLs耐药基因总检出率为96.32%(131/136),1株外膜通道蛋白oprD2基因缺失,AMEs耐药基因总检出率为100%(136/136),Ⅰ类整合子遗传标记基因qacEΔ1-sul1的检出率为94.12%(128/136),未检出Ⅱ类与Ⅲ类整合子基因。BLs基因和AMEs基因与qacEΔ1-sul1遗传标记基因的同时携带率分别为90.44%(123/136)和94.12%(128/136),两类同时携带率之间的差异不具统计学意义(P>0.05),上述两类耐药基因与qacEΔ1-sul1遗传标记基因的三者同时携带率为90.44%(123/136)。此外,还检出16S rRNA甲基化酶基因12株(8.82%),其中,armA与rmtB的检出率分别为2.21%和7.35%,未检出rmtA、rmtC和rmtD。接合试验与质粒图谱结果初步表明:armA和rmtB编码基因位于约23 kb的质粒上,其耐药质粒在同种菌间的传递率高达83.3%(10/12)。【结论】多重耐药E.coli临床株的BLs基因、AMEs基因与qacEΔ1-sul1遗传标记基因三者同时携带率高达90.44%,表明多重耐药的形成在三者间具有密切的相关性;实验结果还显示:E.coli临床株的多重耐药性形成和传播与Ⅱ和Ⅲ类整合子基因无关。另外,16S rRNA甲基化酶基因携带率为8.82%(armA 2.21%�
- 韩冬青黄俊伟尚忠波徐荣楼永良陈秀枢
- 关键词：大肠埃希菌多重耐药Β-内酰胺酶整合子
- 壳聚糖微球固定化重组TEM-116型ESBL的研究被引量：2
- 2011年
- 目的利用固定化酶技术,使重组TEM-116型超广谱β-内酰胺酶(ESBL)在清除环境中残留抗生素的应用中可重复使用,并改善其稳定性。方法以戊二醛为交联剂将重组TEM-116型ESBL固定于壳聚糖微球载体,并采用单因素轮换法和响应曲面法对固定化条件进行优化。结果 4℃条件下,当戊二醛浓度0.54%、交联pH5.4、给酶量0.58IU/g壳聚糖微球、固定化pH6.2时,固定化酶的酶活和回收率分别可达到0.49IU/g和84%(0.49IU/0.58IU)。与游离酶相比,固定化酶的酸碱稳定性和可重复利用性得到显著提高,在pH5.8～7.4范围内酶活性保持在73%～100%的水平,经7次重复性使用,每次1h,酶活力保留高达80%。结论通过固定化酶技术,以重组TEM-116型ESBL为代表的耐药酶能够开发为具有广泛应用前景的环保制剂,以消除外环境中残留的抗生素。
- 徐荣韩冬青王震楼永良陈秀枢
- 关键词：壳聚糖固定化酶超广谱Β-内酰胺酶
- blaTEM-116型超广谱β-内酰胺酶的表达、纯化及其应用被引量：2
- 2010年
- 为大量获取低成本的TEM-116超广谱β-内酰胺酶,并分析其降解环境中β-内酰胺类抗生素残留物的可行性,本研究在Escherichia coli BL21(DE3)菌株中表达了重组TEM-116超广谱β-内酰胺酶,经亲和层析纯化、柱复性与分子筛层析纯化,得到了高纯度的目的蛋白,对其理化性质进行了分析。结果表明,重组TEM-116超广谱β-内酰胺酶的分子量、比活性分别为30kDa和476IU/mg,与天然酶性质相近。重组酶在体内外对多种青霉素、头孢菌素类药物均具有较高降解效率:10IU酶可清除1L发酵液中7000mg的青霉素G;320IU酶可清除1L尿液中各200mg的青霉素G、氨苄青霉素和头孢唑林混合抗生素;1.0～2.5IU的酶可在4℃～37℃温度范围内清除1L牛奶中80U的青霉素G;2.0×104～2.3×104IU/(kg·bw)的酶能够清除小鼠体内8.0×104～9.1×104μg/(kg·bw)的青霉素G。
- 王震郑颖范泉水陈秀枢吕建新
- 关键词：超广谱Β-内酰胺酶纯化
- Pro167位点突变型CTX-M-14超广谱β-内酰胺酶的动力学特征被引量：2
- 2011年
- 目的 对Pr0167位点突变型CTX-M-14超广谱β-内酰胺酶（ESBL）的动力学特征进行分析与评价.方法 以携带CTX-M-14基因的大肠埃希菌临床株为模板,克隆目的 基因,重组工程菌,并表达CTX-M-14型ESBL.进而采用基于重叠延伸PCR法的定点突变技术,将CTX-M-14型ESBL的167位点Pro（P）分别突变为Gly（G）、Gln（Q）、Ser（S）和Thr（T）,重组构建P167G、P167Q、P167S和P167T四株突变型的CTX-M-14工程菌.表达与纯化野生型、重组型和突变型CTX-M-14型ESBL,检测其水解β-内酰胺类抗菌素的酶动力学参数（Kcat、Km和Km）.结果 对野生型与重组型CTX-M-14型ESBL的酶动力学参数进行配对t检验,结果显示两者Kcat（t=1.796,P=0.123）、Km（t=0.559,P=0.596）、Kcat/Km（t=0.893,P=0.406）间的差异无统计学意义（P〉0.1）.与重组CTX-M-14型ESBL相比,P167S突变型酶对头孢他啶的Km值大幅降低,为突变前的1/16（8.39/134.85）;Kcat和Km值分别为突变前的2.87倍（1.81/0.63）和43.6倍（0.218/0.005）;且对青霉素、氨苄西林、头孢唑啉、头孢呋辛、头孢曲松和头孢噻肟的Kcat/Km值都呈现出显著减小的趋势（P〈0.05）.与重组CTX-M-14 ESBL相比,P167Q和P167G突变型酶对头孢他啶的Kcat值亦大幅减小（P〈0.01）,而P167T突变型对头孢他啶的酶动力学参数无明显变化.结论 重组型与野生型CTX-M-14 ESBL之间各项酶动力学参数的差异无统计学意义（P〉0.1）.而P167S位点的突变,不仅增强了CTX-M-14型ESBL对头孢他啶的亲和力,也加快了酶-底物复合物的转换速率.通过对Pr0167位点4种突变型酶的动力学参数比较,初步说明突变型CTX-M ESBL对头孢他啶所具备的高水解活性机制,不能简单地归结于Pro167位点被小侧链氨基酸残基取代而导致酶活性中心空间扩大的解释.
- 徐荣尚忠波黄俊伟韩冬青王震楼永良陈秀枢
- 关键词：超广谱Β-内酰胺酶CTX-M突变酶动力学
- 大肠埃希菌16S rRNA甲基化酶基因的接合传递及其与整合子的相关性被引量：1
- 2011年
- 目的对临床分离的多重耐药(MDR)大肠埃希菌株的16SrRNA甲基化酶基因特征与接合传递效率进行研究,探讨其与整合子的相关性。方法 136株MDR大肠埃希菌经PCR筛检16SrRNA甲基化酶基因armA、rmtA、rmtB、rmtC、rmtD;对阳性菌株作整合酶基因intI1、intI2和intI3检测,并扩增Ⅰ类整合子可变区插入片段,对扩增产物进行测序与鉴定所含耐药基因盒;以阳性菌株为供体菌,耐叠氮化钠大肠埃希菌J53为受体菌进行接合试验,并结合质粒图谱对16SrRNA甲基化酶基因进行初步定位。结果在136株多重耐药大肠埃希菌中,共检出16SrRNA甲基化酶阳性菌12株(8.8%),其中,armA阳性3株(2.2%),rmtB阳性10株(7.4%),未检出rmtA、rmtC、rmtD基因。阳性菌株均只含Ⅰ类整合子,对其可变区扩增片段(1000～2300bp)的测序结果显示,该区域含有多种耐药基因盒,但不含16SrRNA甲基化酶基因。接合试验与质粒图谱结果初步表明armA和rmtB编码基因位于约23000bp的质粒上,接合试验的耐药质粒传递率高达83.3%(10/12)。结论在MDR大肠埃希菌中,armA和rmtB编码基因位于约23000bp质粒上,其中,rmtB为优势基因,接合试验和质粒图谱证明该类耐药质粒很容易在同种菌间传播。Ⅰ类整合子与16SrRNA甲基化酶基因虽然存在于同一菌体内和/或同处于一个质粒上,但整合子基因盒对该类基因的捕获率很低或根本不捕获。
- 韩冬青徐荣尚忠波黄俊伟楼永良陈秀枢
- 关键词：多重耐药大肠埃希菌氨基糖苷类抗生素整合子
- 多重耐药大肠埃希菌喹诺酮类外排基因qepA的研究被引量：2
- 2013年
- 目的对临床分离的多重耐药大肠埃希菌(E.coli)喹诺酮外排泵基因qepA的携带率、接合传递、基因功能等进行研究。方法临床分离的多重耐药E.coli 136株,经PCR筛选qepA基因,阳性菌株作16S rRNA甲基化酶基因rmtB的检测,PCR产物均经测序确认;阳性菌株进行质粒接合实验;扩增qepA基因全长,与pET-12a质粒连接,构建重组质粒,以研究qepA功能。结果 136株多重耐药E.coli qepA基因的检出率为14.0%(19/136),其中16株携带rmtB基因,二者的共存率高达84.2%(16/19)。接合实验的耐药质粒传递率为63.2%(12/19),9株接合子中检出rmtB基因,占75.0%(9/12)。与E.coli BL21(pET-12a)相比,诺氟沙星、环丙沙星和左氧氟沙星对E.coli BL21(pET-12a-qepA)的MIC分别升高64倍、32倍和4倍;而与羰基氰氯苯腙(CCCP)联合应用时三种药物的MIC值则至少降低为原值的1/4。进一步检测菌体内环丙沙星含量,在不含CCCP时,E.coli BL21(pET-12a-qepA)菌体中环丙沙星低于E.coli BL21(pET-12a)或E.coli BL21(P<0.01);加入CCCP后,菌体内环丙沙星含量明显升高(P<0.01)。结论本组多重耐药E.coli的qepA基因检出率较高(14.0%)。qepA基因和rmtB基因具有较密切的相关性和共存率,且容易在菌际间传播。QepA为质子依赖的外排蛋白,可降低某些喹诺酮类药物在细菌体内的含量,使得对药物的敏感性下降。
- 尚忠波黄俊伟刘敏徐荣韩冬青楼永良陈秀枢
- 关键词：多重耐药大肠埃希菌喹诺酮QEPA
