北京市自然科学基金(5042024)
- 作品数：25 被引量：34H指数：4
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- 应用抑制性消减杂交技术筛选丙型肝炎病毒非结构蛋白2反式调节基因被引量：3
- 2005年
- 目的:构建丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白2(NS2)反式调节基因cDNA消减文库,研究HCVNS2蛋白的反式调节基因。方法:应用抑制性消减杂交(SSH)技术筛选转染pcDNA3.1(-)NS2和空载体pcDNA3.1(-)的HepG2细胞差异性表达基因,并进行生物信息学分析。结果:获得12个差异表达的已知蛋白基因和3个未知功能基因序列,包括:磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(glypican3,GPC3)、酸性核糖体磷蛋白PO、核糖体蛋白L13a、整合素β1、天冬酰胺合成酶、信号肽酶、α2HS糖蛋白、小核糖体蛋白多肽G、蛋白酶样亚单位、黄体酮受体、SDR家族脱氢酶8、Ras家族RAB4A、具有BTB/POZ结构的新蛋白、具有coiled coil helix结构的新蛋白、未知功能基因。结论:成功构建HCVNS2反式调节的相关基因cDNA消减文库,为今后进一步分析、研究病毒蛋白的致病机制提供了线索。
- 张黎颖成军刘妍郭江黄燕萍吴顺华吴煜邵清
- 关键词：反式调节基因抑制性消减杂交技术CDNA消减文库PCDNA3黄体酮受体
- 新基因TAHCCP1编码蛋白对NS3TP6基因启动子转录活性的调节
- 2008年
- 目的探讨丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白反式激活基因TAHCCP1编码蛋白对NS3TP6启动子转录活性的调节。方法以我室前期克隆的TAHCCP1基因表达谱芯片结果为基础,利用生物信息学方法确定NS3TP6基因的启动子区域(NS3TP6-p),聚合酶链反应(PCR)扩增并克隆至真核报告载体pCAT3-basic中,构建重组报告质粒pCAT3-NS3TP6-p;以该质粒单独或与pcDNA3.1(-)-TAHCCP1共转染肝癌细胞系HepG2细胞,用酶联免疫吸附法(ELISA)检测氯霉素乙酰转移酶(CAT)的表达活性;观察细胞中表达的TAHCCP1蛋白对NS3TP6启动子转录活性的调节。结果构建的重组表达载体pCAT3-NS3TP6-p在HepG2细胞中能够启动报告基因CAT表达,表明克隆的NS3TP6启动子有指导下游基因转录表达的活性;共转染实验中pCAT3-NS3TP6-p与pcDNA3.1(-)-TAHCCP1组CAT的表达活性是对照组的3.1倍,说明TAHCCP1蛋白能够在转录水平反式激活NS3TP6基因启动子活性。结论本实验验证了基因芯片的实验结果准确性,进一步完善了新基因TAHCCP1的生物学功能,为深入理解HCV核心蛋白的反式激活调节机制提供了新的依据。
- 白文林刘妍徐东平纪冬邵清楼敏
- 关键词：反式调节启动子
- HBeAg结合蛋白4剪切体HBeBP4A基因酵母表达载体的构建及表达研究
- 2007年
- 目的在真核生物酵母细胞中表达乙型肝炎病毒e抗原结合蛋白4基因剪切体HBeBP4A基因。方法以pcDNATM3.1/myc-HisA-HBeBP4A重组质粒作为模板,经RT-PCR扩增HBeBP4A基因,克隆到pGEM-T载体中并测序鉴定,酶切回收后连接到酵母表达质粒pGBKT7中并转化酵母AH109,色氨酸缺陷型培养基(SD/-Trp)上筛选阳性菌落,提取酵母蛋白质,行SDS-PAGE电泳和Western blotting分析。结果成功扩增出HBeBP4A基因,测序结果符合GenBank报告序列。酶切回收的HBeBP4A基因片段成功克隆入酵母表达载体pGBKT7并转化入酵母细胞AH109中,Western blotting分析显示该基因在酵母细胞中表达,表达产物相对分子量为61.37kD。结论成功构建了HBeBP4A酵母表达载体,并在酵母细胞中表达。
- 张健康成军郭江刘春艳赵龙凤洪源
- 关键词：剪切体基因表达
- 病毒性肝炎中一氧化氮合酶调节的分子生物学机制被引量：1
- 2005年
- 研究发现一氧化氮(NO)参与肝细胞的多项生理功能的调节,参与各种肝病的病理过程。一氧化氮具有潜在的抗病毒活性,一氧化氮合酶(NOs)作为产生一氧化氮的限速酶,不但参与一氧化氮的生成,还与一氧化氮的各种生理功能密切相关。了解与阐明肝细胞中一氧化氮合酶的分子生物学作用调节机制。
- 郭风劲成军宋方洲
- 关键词：一氧化氮一氧化氮合酶病毒性肝炎
- 乙型肝炎病毒e抗原结合蛋白4基因剪切体HBeBP4A的克隆与原核表达
- 2007年
- 目的:克隆乙型肝炎病毒e抗原结合蛋白未知功能新基因HBeBP4的剪切体基因HBeBP4A,构建其原核表达载体,诱导在大肠埃希菌中表达。方法:应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术及生物信息学(bioinformat-ics)技术从HepG2细胞提取的cDNA模板中扩增获得HBeBP4基因的剪切体基因HBeBP4A,选用pGEM-T-easy载体进行TA克隆,通过PCR、限制性酶切分析及测序进行鉴定,再将其亚克隆到原核表达载体pET-32a(+)中,转化进BL21(DE3)宿主菌,IPTG诱导HBeBP4A融合蛋白的表达,表达产物进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析,考马斯亮蓝染色,以抗-His的单克隆抗体进行Western blotting免疫印迹分析鉴定证实表达蛋白的特异性。结果:成功扩增出HBeBP4剪切体基因HBeBP4A,并将其插入pET-32a(+)原核表达载体,经BL21(DE3)受体菌转化、IPTG诱导、SDS-PAGE分析获得了HBeBP4A重组蛋白的表达,Western blotting证实了重组蛋白表达的特异性。结论:发现了乙型肝炎病毒e抗原结合蛋白4(HBeBP4)基因的剪切体HBeBP4A,构建了pET-32a(+)-HBeBP4A原核表达载体,并利用大肠埃希菌原核表达系统成功获得了pET-32a(+)-HBeBP4A重组蛋白的表达。
- 张健康郭江成军伦永志王丹琼赵龙凤蓝贤勇洪源毛羽
- 关键词：E抗原结合蛋白剪切体生物信息学原核表达
- 丙型肝炎病毒非结构蛋白NS4B反式激活基因的克隆化研究被引量：4
- 2005年
- 目的 应用抑制性消减杂交 (suppressionsubtractivehybridization ,SSH)技术构建丙型肝炎病毒 (HCV)非结构蛋白 4B(NS4B)转染细胞差异表达cDNA消减文库 ,克隆HCVNS4B蛋白反式激活相关基因。方法 以HCVNS4B表达质粒pcDNA3 .1( ) NS4B转染HepG2细胞 ,以空载体pcDNA3 .1( )为对照 ,制备转染后的细胞裂解液 ,提取mRNA并逆转录为cDNA ,进行抑制性消减杂交分析。将富集的二次PCR产物与T A载体连接 ,并转染大肠杆菌进行文库扩增 ,随机挑取克隆聚合酶链反应 (PCR)扩增后进行测序及同源性分析。结果 文库扩增后得到 3 3个阳性克隆 ,经菌落PCR分析显示其中 2 8个克隆含有大小不等的 2 0 0～ 10 0 0bp插入片段。测序及同源性分析显示 ,12种已知基因编码蛋白 ,包括一些与细胞周期、信号传导及肿瘤发生等细胞生长调节密切相关的蛋白编码基因 ,可能是NS4B反式激活靶基因。结论 成功构建了HCVNS4B反式激活基因差异表达的cDNA消减文库 ,为进一步阐明HCVNS4B反式调节的靶基因在肝炎。
- 刘妍成军王建军白桂芹王志凌郭风劲纪冬崔玉芳
- 关键词：NS4B反式激活基因克隆化研究CDNA消减文库基因编码蛋白
- 应用抑制性消减杂交技术克隆和筛选PS1TP5反式激活相关基因
- 2009年
- 目的构建乙型肝炎病毒前-S1蛋白反式激活基因5(PS1TP5)的反式激活相关基因差异表达的cDNA,克隆PS1TP5蛋白反式激活相关基因。方法以PS1TP5表达质粒pcDNA3.1(-)-myc-his(A)-PS1TP5转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)-myc-his(A)为对照,制备转染后的细胞裂解液,提取mRNA并合成cDNA,经RsaⅠ酶切后将实验组cDNA分成两组,分别衔接两种不同接头,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次PCR反应,产物与T/A克隆载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆经PCR鉴定后进行测序及同源性分析。结果成功构建人PS1TP5蛋白反式激活相关基因差异表达的cDNA。扩增后得到70个200～1 000 bp插入片段的克隆,随机挑选其中30个插入片段测序,并通过生物信息学分析获得其全长基因序列,结果共获得24种编码基因,其中1个为未知功能的新基因,电子拼接后命名为HBV PS1TP5TP1(乙型肝炎病毒前-S1蛋白反式激活蛋白5反式激活蛋白1),GenBank注册号DQ487761。结论筛选到的cDNA全长序列,包括一些与细胞生长调节、物质代谢和细胞凋亡密切相关的蛋白编码基因。PS1TP5与人类免疫调节、物质代谢、信号转导、肝纤维化形成、肿瘤发生发展有密切关系。为进一步研究HBV前-S1蛋白的功能提供了新的线索。
- 张健康刘春燕成军郭江赵龙凤洪源毛羽
- 关键词：乙型肝炎病毒前-S1蛋白抑制性消减杂交
- 丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5B反式激活基因的克隆化研究
- 2005年
- 目的:应用抑制性消减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH)技术构建丙型肝炎病毒非结构蛋白5B(HCV NS5B)转染细胞差异表达cDNA消减文库,克隆HCV NS5B蛋白反式激活相关基因.方法:以HCV NS5B表达质粒pcDNA3.1(-)-NS5B转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为对照,制备转染后的细胞裂解液,提取mRNA并逆转录为cDNA,进行抑制性消减杂交(SSH)分析.随机挑取克隆进行测序及同源性分析.结果:文库扩增后得到35个阳性克隆,经菌落PCR分析显示其中26个克隆含有大小不等的200～1000 bp插入片段.测序及同源性分析,显示16种已知基因编码蛋白和1种未知功能基因序列,包括一些与细胞周期、信号传导及肿瘤发生等细胞生长调节密切相关的蛋白编码基因,可能是NS5B反式激活靶基因.结论:成功构建了HCV NS5B反式激活基因差异表达的cDNA消减文库,为进一步阐明HCV NS5B反式调节的靶基因在肝炎、肝纤维化和肝细胞癌发生的分子生物学机制提供理论依据.
- 刘妍白桂芹成军王志凌张黎颖纪冬
- 关键词：C型肝炎样病毒属病毒非结构蛋白质类
- 乙型肝炎病毒前S1蛋白反式激活基因5在酵母细胞中的表达
- 2007年
- 目的在真核生物酵母细胞中表达乙型肝炎病毒前S1蛋白反式激活基因5(PS1TP5)。方法以HepG2细胞来源的mRNA为模板,经RT-PCR法扩增PS1TP5基因,克隆到pGEM-T载体中,并测序鉴定,酶切回收后连接到酵母表达质粒pGBKT7中,并转化酵母AH109,色氨酸缺陷型培养基(SD/-Trp)上筛选阳性菌落,提取酵母蛋白质,进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western免疫印迹分析,以明确PS1TP5是否可在其中表达。结果成功扩增出PS1TP5,测序鉴定符合基因库报告序列,酶切回收的PS1TP5基因片段成功克隆入酵母表达载体pGBKT7,并转化入酵母细胞AH109中,Western免疫印迹显示该基因在酵母细胞中成功表达,表达产物相对分子质量为36950。结论成功构建了PS1TP5酵母表达载体,并在酵母细胞中表达。
- 张健康成军郭江伦永志王丹琼赵龙凤洪源毛羽
- 关键词：前S1蛋白酵母菌基因表达
- 人肝再生增强因子上调细胞周期素B2基因的表达被引量：5
- 2006年
- 目的研究人肝再生增强因子(ALR)转基因表达对细胞周期素B2启动子(cyclin B2p)转录的调节作用,从而进一步探讨ALR的生物学作用及机制。方法根据文献确定细胞周期素B2p区域,聚合酶链反应(PCR)扩增细胞周期素B2p,克隆至报告基因表达载体pCAT3-Basic中,构建pCAT3-cyclin B2p报告载体;以该质粒转染肝癌细胞系HepG2细胞系,同时与ALR的真核表达载体pcDNA3．1(-)-ALR共转染HepG2细胞系,用酶联免疫吸附法(ELISA)检测报告基因氯霉素乙酰转移酶(CAT)的表达活性。结果成功构建pCAT3- cyclin B2p报告基因表达载体;pCAT3-cyclin B2p与pcDNA3．1(-)-ALR共转染HepG2细胞系的CAT表达活性是pCAT3-Basic空载体的25．13倍,是pCAT3-cyclin B2p单转染的2．60倍。结论人ALR对细胞周期素B2p基因的转录表达具有反式激活作用。
- 邵凤娟成军马英骥郭江刘妍王巧侠
- 关键词：肝再生增强因子启动子反式激活
