浙江省科技计划项目(2004F11018)
- 作品数：5 被引量：36H指数：4
- 相关作者：张文元房国坚杨亚冬陈勇边敏章更多>>
- 相关机构：浙江省医学科学院更多>>
- 发文基金：浙江省科技计划项目更多>>
- 相关领域：医药卫生更多>>
- 不同冻存时间与温度对兔骨髓基质干细胞存活率的影响被引量：4
- 2006年
- 目的:以二甲基亚砜作为保护剂,采用慢冻快融法观察不同温度及不同时间冻存的兔骨髓基质干细胞复苏后存活率的变化。方法:实验于2003-09/2005-06在浙江省医学科学院生物工程所完成。①选取清洁级3月龄新西兰大白兔5只,抽取兔髂骨及胫骨的骨髓液,密度梯度离心法结合贴壁培养法分离纯化出兔骨髓基质干细胞,并进行增殖。②取第3代骨髓基质干细胞,经消化后离心重悬,用完全培养液调整细胞浓度为6×109L-1。将质量浓度为250g/L的二甲基亚砜缓慢滴入同体积含骨髓基质干细胞的上述培养液中,混匀,二甲基亚砜的终浓度为125g/L,骨髓基质干细胞的终密度为3×109L-1,1mL/安瓿冻存。③4℃冻存直接将安瓿置4℃冰箱中;-20℃及-60℃冻存,则将安瓿置于有脱脂棉的聚丙烯泡沫盒中,壁厚1.5cm,扎紧密封,各置-20℃及-60℃冰箱过夜,取出后分别直接放于-20℃及-60℃冰箱保存;-196℃液氮冻存,则将置有安瓿的泡沫盒于-60℃冰箱过夜后,取出冻存安瓿直接放于液氮中保存。骨髓基质干细胞分别于4℃、-20℃、-60℃、-196℃条件下进行3d,10d,1,3,8个月以及1年的冻存。④经不同温度及不同时间冻存后,给予复苏。复苏时将冻存安瓿从液氮或冰箱中取出,立即置37℃水浴并轻轻摇动,约1min迅速解冻。含骨髓基质干细胞的冻存液经5倍于冻存液量的完全培养液稀释后,离心重悬,进行骨髓基质干细胞存活率测定。复苏后的骨髓基质干细胞以1×104/cm2用完全培养液再培养,观察骨髓基质干细胞的形态变化及生长活性情况。结果:实验选取3月龄新西兰大白兔5只,全部进入结果分析。①兔骨髓基质干细胞原代培养情况:培养3d时,骨髓基质干细胞数量较少,散在分布,呈短梭形形态。培养1周时细胞形成大量的小集落,细胞变长。此后集落细胞迅速增多,逐渐汇合成片,形态为均一的长梭形,呈旋涡状排列,2周时�
- 张文元杨亚冬房国坚陈勇
- 关键词：干细胞低温保藏二甲亚砜复苏术存活率
- 巢式PCR扩增性别决定基因序列检测兔骨髓间充质干细胞移植治疗关节软骨缺损的修复组织来源被引量：6
- 2007年
- 目的:明确骨髓间充质干细胞移植到关节软骨损伤处后,该处修复组织的细胞来源,以了解组织修复的过程。方法:实验于2006-01/2007-01在浙江省医学科学院生物工程所完成。①实验材料:3月龄新西兰大白兔,清洁级,体质量约2kg,由浙江省实验动物中心提供。②实验方法:利用兔性别决定基因序列设计两对PCR引物。取雄性新西兰大白兔进行骨髓间充质干细胞的分离培养与扩增。取雌性新西兰大白兔,暴露其膝关节软骨,用电钻钻孔造成膝关节软骨内侧直径4.5mm深3.5mm的全层关节软骨缺损,达软骨下骨。一侧植入骨髓间充质干细胞/胶原海绵,另一侧仅植入胶原海绵。③实验评估:于术后1,2,3,4,5个月取兔关节软骨缺损修复处组织提取总DNA,进行PCR扩增,鉴定移植物中是否存在性别决定基因,以明确细胞来源。结果:移植后1,2,3,4,5个月移植雄兔骨髓间充质干细胞及胶原海绵的关节修复处组织提取的DNA,用设计的引物通过PCR扩增出一条约200bp大小的条带,大小与阳性对照一致;而另一侧仅移植胶原海绵的关节软骨修复处组织提取的DNA,用设计的引物通过PCR扩增后未发现有条带。PCR扩增阳性样本测序分析显示,每个样本碱基序列一致,与GenBank上性别决定区Y基因组gb|AY785433.1|比较,扩增的样本序列与标准序列完全一致,序列同源性达100%。结论:雌兔关节骨髓间充质干细胞/胶原海绵复合物移植处的新生组织中含有雄性组织,提示新生软骨中有移植的雄性骨髓间充质干细胞分化来的软骨细胞。
- 杨亚冬张文元房国坚沃恩康何卓晶洪艳陈勇
- 关键词：性别决定基因骨髓间充质干细胞关节软骨缺损
- 兔骨髓基质干细胞的分离生长及冻存技术研究被引量：14
- 2005年
- 目的:建立兔骨髓基质干细胞(MSC)体外分离、培养、增殖、冻存的方法,以及探讨其生物学特性。方法:抽取兔髂骨及胫骨的骨髓液,采用密度梯度离心法结合贴壁培养法分离纯化出MSC,并增殖。观察MSC的生长特性,测定其贴壁率及第3、8、13、18代的生长曲线,并评价其生物学特性。MSC在12.5%DMSO条件下经液氮或-60℃冻存复苏,测其成活率。结果:MSC为贴壁生长,以均一的梭形的成纤维细胞样生长,贴壁及增殖能力强,所测各代的生长曲线呈相似的S型,倍增时间约为35h。MSC需液氮保存,短期也可-60℃冰箱保存。结论:获得的兔MSC生长旺盛、增殖能力强,其分离、培养、纯化、增殖、冻存方法是可行的,可较长时间稳定地培养增殖、冻存,传代的MSC可保持其原代的生物学特性。MSC将是组织工程理想的种子细胞。
- 张文元杨亚冬房国坚边敏章陈勇
- 关键词：骨髓基质干细胞冻存技术冻存复苏液氮保存冰箱保存骨髓液
- 兔骨髓间充质干细胞表面抗原检测及其变化特点被引量：2
- 2007年
- 目的:应用流式细胞仪对兔骨髓间充质干细胞的表面抗原进行检测,观察骨髓间充质干细胞传代次数、克隆纯化与骨髓间充质干细胞表面抗原表达之间的关系。方法:实验于2004-01/2006-08在浙江省医学科学院生物工程所完成。取3月龄新西兰大白兔用于骨髓间充质干细胞的分离培养。兔骨髓间充质干细胞的克隆化:将铺满培养瓶底的原代骨髓间充质干细胞,用D-Hanks液小心的洗1次,加入0.25%胰蛋白酶消化约4min,弃消化液,加LG-DMEM培养液收集细胞,1000r/min,离心10min,然后用LG-DMEM培养液充分混匀沉淀细胞。细胞计数后以10倍递减稀释至细胞密度为103个/mL。取0.1mL稀释后的细胞悬液加入10mL培养液,使最终细胞密度为10个/mL。将细胞悬液加入96孔培养板,每孔100μL。置37℃、体积分数为0.05的CO2饱和湿度条件下培养,每天观察克隆细胞的增殖生长状况。待克隆细胞生长至60%～80%融合时,逐步扩大培养,在液氮冻存保种的同时进行细胞连续传代。将体外普通法分离的骨髓间充质干细胞第5代、第7代、第13代、第16代、第21代、第22代及克隆纯化的骨髓间充质干细胞第3代、第5代、第15代、第26代均标记上CD14-FITC及CD44-PE,通过流式细胞仪检测其阴性率及阳性率。结果:①普通法分离的骨髓间充质干细胞各代的CD44表达呈阳性,且随着培养代次的增加,其表达的阳性率逐渐增强,到P16代以后又呈下降趋势;各代骨髓间充质干细胞表面抗原CD14出现了微弱阳性,但随着培养代次增加,其阳性率呈下降趋势。②克隆纯化的骨髓间充质干细胞其CD44呈现阳性,表达在80%以上,至P26代时CD44表达下降到70.49%;其CD14基本呈阴性。结论:兔骨髓间充质干细胞其CD44呈阳性表达,CD14呈阴性表达。随着传代代数增加CD14阴性符合率逐渐提高,CD44阳性表达率也提高。普通法分离的骨髓间充质干细胞较克隆纯化的骨髓间充�
- 杨亚冬张文元房国坚陈勇
- 关键词：间质干细胞细胞学抗原抗原CD44抗原
- 诱导和非诱导骨髓基质干细胞在关节软骨缺损处成软骨的效应比较被引量：12
- 2007年
- 目的:探讨经体外诱导和非诱导的骨髓基质干细胞复合胶原海绵修复兔膝关节全层软骨缺损成软骨效应的差异。方法:实验于2005-01/2006-06在浙江省医学科学院生物工程研究所完成。①将兔骨髓基质干细胞与载体胶原海绵共培养6h形成骨髓基质干细胞/胶原海绵复合物。②22只新西兰大白兔,分为两组。制备双膝股骨下端滑车的直径4.5mm、深3mm关节软骨缺损模型。未诱导组:一侧植入未经诱导的骨髓基质干细胞/胶原海绵复合物,作为实验侧;另一侧植入单纯胶原海绵,作为对照侧。诱导组:实验侧植入经软骨诱导的骨髓基质干细胞/胶原海绵复合物,对照侧为单纯胶原海绵。③术后未诱导组于0.5,1,2,3,5,7,9个月,诱导组于1,2,3,4,5,7个月分别处死动物,观察缺损修复情况及新生组织类型。参照Pineda标准对新生组织评分。结果:22只兔均进入结果分析:①两组兔材料移植后大体观察结果:未诱导组实验侧:移植后2个月,缺损修复处表面光滑,质地较硬,类似正常软骨,边界已不是很明显。至移植后7个月及9个月,修复组织与正常软骨基本相同。对照侧:移植后2个月,缺损处仍有较明显的凹陷,表面较粗糙,致密性差,质地较软,色泽与周围组织仍有较大差别。至移植后7个月及9个月,表面仍欠平整,质地仍欠坚韧,修复组织为白色纤维样组织,色泽与周围软骨组织仍尚有差别。诱导组大体观察情况与未诱导组相似,无明显差异。②两组兔软骨缺损区形态学观察结果:未诱导组:移植1个月,实验侧原软骨缺损区逐渐被透明软骨样组织取代,与周围软骨组织分界较明显,与周围软骨组织相比,细胞排列相对较不整齐,甲苯胺蓝染色阳性,随着时间的推移,与正常软骨组织结构相似,但并不完全一致。对照侧移植1个月以后未见明显修复,原软骨缺损区取代的主要是略带红色的纤维组织,界面明显,随着时间的
- 张文元杨亚冬房国坚陈勇
- 关键词：间质干细胞软骨关节干细胞移植
