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多聚嘧啶序列结合蛋白相关剪接因子对体外培养的视网膜色素上皮细胞磷脂酰肌醇3激酶/丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶信号通路的调控作用被引量：12: 2015年; 目的：观察多聚嘧啶序列结合蛋白相关剪接因子（PSF）对体外培养的视网膜色素上皮（RPE）细胞磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）/丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶（Akt）信号通路的调控作用。方法将体外培养的 RPE 细胞分为 PSF 高表达组、PSF 高表达对照组、PSF 低表达组、PSF 低表达对照组及假转染组。应用脂质体2000将上调 PSF 表达的真核质粒增强型绿色荧光蛋白（pEGFP）-C2-PSF、下调 PSF 表达的真核质粒 pGenesil-PSF-RNAi 以0.25、0.50、1.00μg 的递增量分别转染至 PSF 高表达组及 PSF 低表达组细胞。PSF 高表达对照组细胞转染 pEGFP-C2空载质粒。PSF 低表达对照组细胞转染 pGenesil-scramble-siRNA 质粒。假转染组仅做转染处理,不加入任何表达质粒。采用水溶性四氮唑法检测胰岛素样生长因子1（IGF-1）刺激条件下 PSF 对 RPE 细胞增生的影响。应用脂质体2000将0.50μg 真核质粒pEGFP-C2-PSF、1.00μg 真核质粒 pGenesil-PSF-RNAi 及 pEGFP-C2空载质粒转染细胞分别作为 PSF 高表达组、PSF 低表达组、对照组,采用实时定量聚合酶链反应（PCR）检测 PSF 对 IGF-1诱导的 RPE 细胞内血管内皮生长因子（VEGF）mRNA 表达的影响。采用蛋白免疫印迹法（Western blot）检测 PSF 对 IGF-1诱导的磷酸化 Akt （pAkt）蛋白表达的影响。在 IGF-1刺激后,将 RPE 细胞分为单纯渥曼青霉素（Wortmannin）处理组、单纯 PSF 高表达组、渥曼青霉素联合 PSF 高表达处理组,并以未经渥曼青霉素处理的常规体外培养的 RPE 细胞为对照组,采用实时定量 PCR 检测各组 VEGF 的表达。结果IGF-1刺激后,PSF 高表达组、PSF 高表达对照组及假转染组之间 RPE 细胞增生率比较,差异有统计学意义（F =29.728,P 〈0.05）；PSF 低表达组、PSF 低表达对照组及假转染组之间 RPE 细胞增生率比较,差异有统计学意义（F =14.121,P〈0.05）。PSF 高表达组 RPE 细胞中 VEGF mRNA 表达较对照组�; 漆晨东莉洁东莉洁张晓敏李筱荣张晓敏茹玉莎李筱荣; 关键词：磷酸肌醇

氧诱导视网膜病变小鼠模型微小RNA表达谱分析被引量：4: 2015年; 目的分析氧诱导视网膜病变（OIR）小鼠模型的微小RNA表达谱,筛选可能与视网膜新生血管（RNV）形成有关的微小RNA.方法 7日龄健康C57BL/6J小鼠52只随机分为正常对照组和OIR组,每组26只.OIR组建立OIR小鼠模型;正常对照组不做任何处理.小鼠17日龄时,行视网膜铺片,观察视网膜血管形态;行视网膜石蜡切片,计数突破内界膜的视网膜血管内皮细胞核数;行微小RNA芯片分析,检测具有差异表达的微小RNA,再应用实时聚合酶链反应（RT-PCR）进行验证.结果正常对照组小鼠视网膜血管平滑、均匀有序分布;OIR组小鼠周边视网膜血管纡曲、紊乱并伴有新生血管芽,中央视网膜无灌注区明显.正常对照组、OIR组小鼠视网膜无灌注区的相对面积分别为（6.57±3.6）％、（25.81±2.12）％;OIR组小鼠视网膜无灌注区的相对面积较正常对照组明显增大,差异有统计学意义（t=28.71,P＜0.001）.光学显微镜观察发现,正常对照组小鼠内界膜结构完整、平滑,血管内皮细胞排列整齐,偶见突破内界膜的血管内皮细胞核.正常对照组、OIR组平均每张切片突破内界膜的视网膜血管内皮细胞核数分别为（0.16±0.31）、（28.41±4.01）个.两组平均每张切片突破内界膜的视网膜血管内皮细胞核数比较,差异有统计学意义（t=54.45,P＜0.001）.微小RNA芯片分析结果显示,与正常对照组比较,OIR组有21个微小RNA的表达发生了1.5倍以上的变化.其中,上调者9个,下调者12个.差异表达倍数≥3.0的微小RNA为miR-3078、miR-140、miR-29b、miR-29c.RT-PCR检测发现,差异表达倍数≥3.0的4个微小RNA,其表达趋势与芯片分析结果一致.与正常对照组比较,OIR组miR-3078的表达明显上调,差异有统计学意义（t=-2.380,P＜0.05）;miR-140、miR-29b、miR-29c的表达明显下调,差异也有统计学意义（t=2.638、2.323、2,415,P＜0.05）.结论 OIR小鼠模型的微小RNA表达谱中,miR-3078、miR-140�; 薄其玉东莉洁张琰周玉刘勋韩倩王飞; 关键词：微RNAS

睫状神经营养因子基因修饰的大鼠骨髓间充质干细胞的构建被引量：2: 2014年; 背景间充质干细胞作为基因转移的载体,已在多种疾病的研究中发挥作用.该方法可能为外源性神经营养因子在中枢神经系统,包括在视网膜中的应用提供更有效的途径. 目的构建慢病毒介导的过表达睫状神经营养因子（CNTF）的骨髓间充质于细胞（BMSCs）,为眼科视网膜、视神经疾病的治疗提供新的方法.方法对SD大鼠BMSCs进行培养和传代,第4代细胞用于实验.将全基因合成含信号肽的大鼠CNTF基因编码序列克隆至pHⅣ-dTomato慢病毒载体质粒,构建重组质粒CNTF-dTomato.CNTF-dTomato/pHⅣ-dTomato与慢病毒辅助质粒psPAX2及pMD2.G共转染293T细胞进行慢病毒包装,获得重组慢病毒CNTF-lenti及不含CNTF的control-lenti.以CNTF-lenti或control-lenti感染SD大鼠BMSCs,构建CNTF-BMSCs及空载-BMSCs细胞,根据红色荧光蛋白dTomato表达情况确定病毒感染效率;未感染lenti的BMSCs为空白-BMSCs.用ELISA法测定空白-BMSCs、空载-BMSCs及CNTF-BMSCs细胞培养液中CNTF的质量浓度.将CNTF-BMSCs向成骨和成脂2个方向诱导分化,并用茜素红S（ARS）染色和油红O染色对分化细胞进行鉴定.结果 CNTF-dTomato质粒转化大肠杆菌Stbl3感受态细胞后,菌落PCR产物大小约为1 033 bp,质粒测序结果显示,pHⅣ-dTomato质粒中插入部分的碱基序列与预期序列一致,显示CNTF-dTomato质粒构建成功.重组慢病毒对BMSCs的感染率达95％.ELISA检测结果显示,感染后2、3、4、7d,CNTF-BMSCs组细胞上清液中CNTF蛋白的质量浓度明显高于空白-BMSCs组及空载-BMSCs组,差异均有统计学意义（均P=0.000）;CNTF-BMSCs组感染后2、3、7d细胞上清液中CNTF质量浓度均明显高于感染后1d,差异均有统计学意义（P=0.013、0.004、0.042）.CNTF-BMSCs经成脂培养基诱导后分化的细胞油红0染色呈红色着染,经成骨培养基诱导后分化的细胞ARS染色可见橘红色钙结节. 结论本研究成功构建CNTF-dTomato质粒,利用慢病毒载体可成功�; 武晶晶华宁东莉洁李筱荣; 关键词：睫状神经营养因子慢病毒载体骨髓间充质干细胞

Surgical induced astigmatism correlated with corneal pachymetry and intraocular pressure: transconjunctival sutureless 23-gauge versus 20-gauge sutured vitrectomy in diabetes mellitus被引量：3: 2015年; AIM: To determine the difference of surgical induced astigmatism between conventional 20-gauge sutured vitrectomy and 23-gauge transconjunctival sutureless vitrectomy, and the influence of corneal pachymetry and intraocular pressure(IOP) on surgical induced astigmatism in diabetic patients.METHODS: This retrospective, consecutive case series consisted of 40 eyes of 38 diabetic subjects who underwent either 20-gauge or 23-gauge vitrectomy. The corneal curvature and thickness were measured with Scheimpflug imaging before surgery and 1wk; 1, 3mo after surgery. We compared the surgical induced astigmatism(SIA) on the true net power in 23-gauge group with that in 20-gauge group. We determined the correlation between corneal thickness change ratio, IOP and SIA measured by Pentacam. RESULTS: The mean SIAs were 1.082 ±0.085 D( mean ± SEM), 0.689 ±0.070 D and 0.459 ±0.063 D at postoperative 1wk; 1, 3mo respectively in diabetic subjects. The vitrectomy induced astigmatisms were declined significantly with time(F2,36=33.629, P =0.000)postoperatively. The 23-gauge surgery group induced significantly less astigmatism than 20-gauge surgery group(F1,37=11.046, P =0.020). Corneal thickness in diabetes elevated after surgery(F3,78=10.532, P =0.000).The linear regression analysis at postoperatively 1wk went as: SIA =-4.519 +4.931 change ratio(Port3) +0.026IOP(R2=0.46, P =0.000), whereas the rate of cornealthickness change and IOP showed no correlation with the change of astigmatism at postoperatively 1 and 3mo.CONCLUSION: There are significant serial changes in both 20-gauge and 23-gauge group in diabetic subjects.23-gauge induce less astigmatism than 20-gauge and become stable more rapidly than 20-gauge. The elevation of corneal thickness and IOP was associated with increased astigmatim at the early postoperative stage both in 23-gauge and 20-gauge surgery group.; Yan ShaoLi-Jie DongYan ZhangHui LiuBo-Jie HuJu-Ping LiuXiao-Rong Li; 关键词：ASTIGMATISM VITRECTOMY INTRAOCULAR

Krüppel样因子6抑制人晶状体上皮细胞增生的研究被引量：4: 2014年; 背景研究表明,Kruppel样因子6（KLF6）与生长发育、细胞分化、增生、凋亡、血管生成及组织修复等生理或病理过程有关.在眼科领域,关于人晶状体上皮细胞（LECs）中KLF6蛋白表达水平及KLF6对LECs增生的影响报道较少. 目的探讨KLF6对LECs株（HLE-B3）增生的抑制作用. 方法首先用逆转录PCR（RT-PCR）法构建真核表达质粒pEGFP-C2-KLF6,并用双酶切法和PCR法对表达质粒进行鉴定.用含体积分数10％胎牛血清的低糖DMEM对HLE-B3进行培养和传代,按照干预方法的不同将培养的HLE-B3分成4个组,各组均给予KLE-B3转染试剂,空白对照组不加入任何外源质粒及胰岛素样生长因子-1（IGF-1）;单纯IGF-1刺激组仅给予IGF-1刺激;空质粒转染＋IGF-1组加入pEGFP-C2质粒空载体,同时给予IGF-1刺激;pEGFP-C2-KLF6转染＋IGF-1组加入pEGFP-C2-KLF6真核表达质粒,且给予IGF-1刺激.细胞干预24 h后,采用水溶性四唑盐-1（WST-1）实验检测各组细胞的吸光度（A450）值;采用Western blot法测定各组细胞中KLF6蛋白的表达水平.以1＆#215;104个/片的密度将HLE-B3细胞爬片培养24 h,并分别将0、0.10、0.25 μg pEGFP-C2-KLF6转染到各组铺片细胞中,用终质量浓度为50 μg/L的IGF-1刺激24 h,然后应用免疫细胞化学技术检测各组细胞中Ki-67蛋白的相对表达量;采用荧光半定量PCR法检测各组细胞中Ki-67 mRNA的表达变化.结果扩增得到的PCR产物反应条带与KLF-6基因长度相符,PCR和EcoR I、Sal I限制性内切酶双酶切法鉴定条带大小与预期相符,成功构建pEGFP-C2-KLF6真核表达质粒.WST-1实验显示空白对照组、单纯IGF-1刺激组、空质粒转染＋IGF-1组和pEGFP-C2-KLF6转染＋IGF-1组细胞A值分别为0.86±0.00、2.10±0.01、2.24±0.12和1.06±0.02,4个组间差异有统计学意义（F=38.322,P＜0.05）,其中pEGFP-C2-KLF6转染＋IGF-1组A值明显低于单纯IGF-1刺激组和空质粒转染＋IGF-1组,差异均有统计学意义（q=6.42�; 周玉东莉洁张红田芳; 关键词：晶状体上皮细胞转染细胞增生

间充质干细胞对EAU大鼠抗原特异性T细胞和抗原递呈细胞功能的抑制作用被引量：3: 2015年; 背景我们前期研究发现,间充质干细胞（MSCs）可以有效治疗大鼠实验性自身免疫性葡萄膜炎（EAU）,减轻组织损害,但其具体作用机制仍在研究中.目的研究MSCs对大鼠EAU模型中T细胞亚群和抗原递呈细胞（APCs）的影响.方法收集6只清洁级4～6周龄Wistar雄性大鼠双侧股骨、胫骨骨髓,采用贴壁培养法纯化Wistar大鼠骨髓MSCs.采用随机数字表法将12只清洁级Lewis雌性大鼠分为MSCs组和PBS组,每组6只.于Lewis大鼠单后足及背部皮下注射200μl含30μg光感受器间维生素A类结合蛋白（IRBP） 1177-1191多肽片段R16及完全弗氏佐剂（CFA）的乳化液以建立EAU模型,造模后于裂隙灯显微镜下观察大鼠眼部炎症表现.造模后9～11d,MSCs组大鼠每日经尾静脉注射密度为5×106/ml的MSCs悬液1 ml;PBS组大鼠以同样的方法注射等容积的PBS.造模后15d,分离各组大鼠脾脏和引流淋巴结中的T细胞及APCs,采用流式细胞仪检测各组大鼠脾脏和引流淋巴结中γ干扰素（IFN-γ）阳性CD4＋T细胞、白细胞介素-17（IL-17）阳性CD4＋T细胞和叉头状螺旋转录因子p3（Foxp3）阳性CD4＋T细胞的比例,以评估辅助性T细胞1（Th1）、Th17和调节性T细胞（Treg）细胞亚群的作用;依据各组T细胞与APCs共培养的方式不同分为PBS共培养组、PBS-MSCs交叉培养组、MSCs-PBS培养组和MSCs共培养组,分别加入不同质量浓度（0.3、1.0、10.0 μg/ml）的R16抗原进行刺激,无R16抗原刺激的细胞作为空白对照,采用5-溴脱氧尿嘧啶核苷（BrdU）法测定各组大鼠T细胞吸光度（A）值,计算T细胞增生指数.结果造模后11、12、13和14d,MSCs组大鼠眼前节炎症评分均明显低于PBS组,差异均有统计学意义（t=3.825、5.100、4.250、3.400,均P＜0.05）.与PBS组大鼠比较,MSCs组大鼠脾脏和淋巴结中IFN-γ＋ CD4＋T细胞比例均明显下降,差异均有统计学意义（t=5.651、4.376,均P＜0.05）;MSCs组大鼠脾脏和引流�; 白伶伶张灵君郑慧王梅艳东莉洁李筱荣张晓敏; 关键词：间充质干细胞免疫抗原递呈细胞

PSF蛋白及其在眼科的应用研究被引量：2: 2015年; 多聚嘧啶束结合蛋白相关剪接因子（polypyramidine tract binding protein-associated splicing factor,PSF）是存在于细胞核内且参与多种细胞反应的多功能蛋白质.经玻璃体腔注射重组腺相关病毒包装的PSF蛋白（rAAV-PSF）可有效抑制氧诱导视网膜病变模型小鼠视网膜新生血管的形成,下调血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）的表达,从而控制新生血管的增生;PSF蛋白通过募集Hakai复合物,下调VEGF启动子的转录激活,从而抑制胰岛素样生长因子（in-sulin-like growth factor,IGF-1）刺激的视网膜血管内皮细胞增生.此外,PSF蛋白通过调控细胞因子信号抑制物3的表达,间接影响JAK/STAT信号通路的活化状态,而在斑马鱼视神经再生中发挥重要作用.; 漆晨郭如如东莉洁张晓敏李筱荣; 关键词：视网膜新生血管视神经再生转录调控

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国家自然科学基金(31100991)

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