目的 从美洲钩虫分离并重组制备一种含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp,RGD)序列的库尼茨(Kunitz)型多肽-美洲钩虫血小板抑制剂1(Na HPI1),鉴定重组Na HPI1(r Na HPI1)对血小板聚集的抑制作用。方法通过美洲钩虫成虫全长转录组测序获得Na HPI1完整cDNA序列,通过在线生物信息学网站检索氨基酸序列同源性蛋白并预测信号肽。根据Na HPI1氨基酸序列合成大肠埃希菌密码子偏爱的成熟肽编码基因序列,将该序列连接入表达质粒构建原核表达重组质粒,鉴定正确的重组质粒pET32a-sumo/Na HPI1,转入大肠埃希菌BL21(DE3)中,用IPTG诱导表达,收集菌体超声破碎后,用Ni-NTA亲和层析纯化重组融合蛋白,并在层析柱上进一步用小泛素蛋白样修饰物(SUMO)蛋白酶切割融合伴侣,收集透析液获得r Na HPI1。体外检测r Na HPI1对凝血酶、二磷酸腺苷(ADP)诱导的血小板聚集的抑制作用。结果 通过全长转录组测序获得了编码Na HPI1的全长mRNA,预测其完整编码框编码包括16个氨基酸组成的信号肽和81个氨基酸残基组成的成熟肽。Na HPI1为Kunitz型结构多肽,并在其最后1个半胱氨酸残基之后的羧基端具有RGD序列。利用大肠埃希菌表达系统成功表达并分离纯化获得了r Na HPI1蛋白。10、20和40μg/mL的r Na HPI1蛋白对ADP(20μmol/L)诱导的血小板聚集的抑制率分别为(17.35±2.77)%、(23.33±2.31)%、(30.94±2.03)%,对凝血酶(1 U/mL)诱导的血小板聚集的抑制率分别为(12.85±1.55)%、(20.28±1.17)%、(27.30±2.11)%。r Na HPI1蛋白对凝血酶及ADP诱导的血小板聚集均有明显抑制作用,差异有统计学意义(P<0.05),并呈一定的剂量依赖关系。结论 本研究分离并鉴定了美洲钩虫的血小板聚集抑制剂Na HPI1的抑制血小板聚集活性,其可能通过抑制血小板聚集而在钩虫吸血时发挥抗凝血作用。
目的分离美洲钩虫(Necator americanus)Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂1(Na Ku I1)c DNA,并进行原核表达,研究其抑制蛋白酶的效果。方法根据Gen Bank上预测的不完整的Na Ku I基因序列(XM_013449790)设计引物,运用快速扩增c DNA末端技术(SMART-RACE)分别从美洲钩虫成虫c DNA中扩增Na Ku I1 c DNA的5′和3′末端序列,拼接获得全长Na Ku I1 c DNA。将Na Ku I1成熟肽编码基因连接入原核表达载体,构建重组质粒p ET32a-sumo/Na Ku I1,转化至大肠埃希菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中,用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导Na Ku I1融合蛋白表达。表达产物包涵体经变性、复性、Ni-NTA亲和层析纯化后,用SUMO蛋白酶切割融合蛋白标签后获得重组蛋白r Na Ku I1。用凝血时间法检测r Na Ku I1的抗凝活性,发色底物法检测其对人纤溶酶、胰蛋白酶、中性粒细胞弹性蛋白酶、组织蛋白酶G和蛋白酶3、猪胰蛋白酶和胰弹性蛋白酶及牛α-胰糜蛋白酶的抑制作用。结果获得Na Ku I1全长c DNA,其编码的多肽由84个氨基酸残基组成,其中含16个氨基酸残基组成的信号肽,68个氨基酸残基组成的成熟肽。成熟肽原核表达产物为不可溶的包涵体。经变性、复性后纯化的r Na Ku I1无抗凝血活性。在100倍摩尔浓度比下,r Na Ku I1对人纤溶酶(5 nmol/L)、人胰蛋白酶(1 nmol/L)和猪胰蛋白酶(5 nmol/L)活性的抑制率近100%,对牛α-胰糜蛋白酶(1 nmol/L)和人中性粒细胞弹性蛋白酶(5 nmol/L)活性的抑制率分别约31.45%和25.18%,对人组织蛋白酶G、蛋白酶3和猪胰弹性蛋白酶均无抑制作用。r Na Ku I1抑制人胰蛋白酶及纤溶酶的抑制常数(ki)分别为(21.17±7.22)和(21.72±3.95)nmol/L。结论成功分离获得Na Ku I1全长c DNA序列,其原核表达产物r Na Ku I1具有较强抑制胰蛋白酶和纤溶酶活性的特点。
