中国博士后科学基金(20060390264)
- 作品数：2 被引量：8H指数：2
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- 在基于BAC的EB病毒基因组中引入突变被引量：4
- 2008年
- 为了在Epstein-Barr病毒(EBV)172kb的基因组中引入突变以研究基因功能,建立了一种简单有效的基因操作方法。在载体pcDNA3.1(+)上操作,将两端含有重组蛋白FLP识别位点(FRT)的卡那霉素筛选标记基因(kan)与鼻咽癌(NPC)来源的、包含LMP1基因全长ORF的gDNA"无缝"连接(无外源序列插入)。连接后的kan-LMP1线性DNA片段经转化、由λ噬菌体中redαβγ系统介导在E.coli中发生同源重组(ET克隆),用kan-LMP1替代了BAC-EBV(p2089)中相应的LMP1基因区域,然后经过重组蛋白FLP对FRT-kan-FRT特异性的识别,切除了引入的kan基因,留下一个69bp的FRT"疤痕"。通过抗性筛选和对菌液进行PCR扩增可以鉴定突变子。这种经改进并程序化的方法,也适应于引入其它突变或在其它BAC-疱疹病毒基因组中引入突变。
- 卢建红唐运莲周鸣武明花欧阳珏高建明张荔茗李丹陈琼熊炜李小玲唐珂李桂源
- 关键词：EB病毒突变同源重组
- 裂解性复制诱导产生可视化重组Epstein Barr病毒被引量：4
- 2007年
- 为了在病毒的整个基因组中研究基因的功能,分析基因与基因之间的相互作用,含有整个野生型EB病毒(EBV)基因组的BAC-EBV质粒(p2089),首先被转染EBV阴性的HEK293细胞,经潮霉素筛选建立了HEK293/p2089稳定细胞系.再构建pcDNA3.1(+)/BZLF1和pcDNA3.1(+)/BALF4真核表达质粒,共转染至HEK293/p2089细胞内,诱导EBV裂解性复制产生可视化的重组EBV颗粒.重组EBV颗粒感染Raji细胞,在倒置荧光显微镜下和流式细胞仪记数GFP阳性细胞,根据这些'绿色Raji单位'确定病毒的滴度.在国内首次建立这种以细菌人工染色体(BAC)为基础的EBV感染性克隆技术,将允许对EB病毒基因组中任何基因的任何遗传修饰,为在整个基因组中对EB病毒基因功能的研究奠定了基础,也为对EBV与其相关的肿瘤如鼻咽癌发生机理的研究建立了新的技术平台.
- 唐运莲卢建红武明花黄琛曹利彭淑平周艳宏李小玲周鸣唐珂李桂源
- 关键词：可视化基因组
