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组织蛋白酶 D 绿色荧光蛋白复合质粒转染技术在慢性光损伤成纤维细胞研究中的作用: 2015年; 目的：探讨组织蛋白酶 D 绿色荧光蛋白复合质粒（GFP-CatD）技术在成纤维细胞慢性光损伤研究中的作用。方法长波紫外线（UVA）25 J/cm2每天照射人皮肤成纤维细胞1次，共21 d，构建慢性光损伤成纤维细胞模型。构建 GFP-CatD 质粒，将其转染入慢性光损伤成纤维细胞，荧光显微镜观察绿色荧光标记的组织蛋白酶 D 表达，Western 印迹检测组织蛋白酶 D 表达，流式细胞仪检测转染 GFP-CatD 后的慢性光损伤成纤维细胞凋亡率，噻唑蓝（MTT）法检测细胞增殖率。结果慢性光损伤成纤维细胞转染 GFP-CatD 质粒96 h，可见绿色荧光蛋白组织蛋白酶 D 在慢性光损伤细胞胞质内表达。Western 印迹结果显示，慢性光损伤成纤维细胞转染 GFP-CatD 质粒后，组织蛋白酶 D 蛋白表达为未转染细胞的1.28倍。细胞凋亡检测结果发现，转染后的光老化成纤维细胞凋亡细胞率为4.29％±1.30％，与无转染的空白对照组凋亡细胞率3.03％±1.70％比较，差异无统计学意义（P 〉0.05）。MTT 细胞增殖检测结果发现，转染后的光老化成纤维细胞的细胞增殖率为45.20％±4.70％，无转染质粒的光老化成纤维细胞为43.60％±3.90％（P 〉0.05）。结论 GFP-CatD 复合质粒转染慢性光损伤成纤维细胞可示踪到组织蛋白酶 D 荧光蛋白，且不影响慢性光损伤成纤维细胞原有的正常生物活性和周期。; 郑跃陈海燕许庆芳叶聪秀刘惠娴易金玲赖维; 关键词：组织蛋白酶D 成纤维细胞质粒细胞衰老皮肤衰老

UVA致人皮肤成纤维细胞急性和慢性光损伤模型的建立被引量：5: 2014年; 目的:探讨人皮肤成纤维细胞(human dermal fibroblasts,HDFs)急性和慢性光损伤模型建立的方法。方法:体外培养原代人皮肤成纤维细胞,选取第4~8代的细胞进行实验。用长波紫外线(UVA)单次照射建立HDFs急性光损伤模型,荧光倒置显微镜观察不同剂量UVA照射后第1、2、3天HDFs的形态变化;CCK-8法检测照射后HDFs的增殖活性。慢性光损伤HDFs模型采用8-甲氧沙林(8-MOP)避光孵育细胞24h,随后以含8-MOP的磷酸盐缓冲液(PBS)置换培养基,行9J/cm^2 UVA照射,照射完成后换Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)(含10%胎牛血清)避光传代培养,21d后显微镜下观察HDFs形态;衰老相关-β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)染色法计算衰老细胞率。结果:单次UVA照射导致HDFs增殖率下降,与UVA剂量呈正相关。UVA在剂量为≤10J/cm^2时,细胞存活率保持在>85%;而UVA剂量≥15J/cm^2时细胞存活率明显降低;≥20 J/cm^2时存活率为50%左右,至25 J/cm^2时仅为约25%。慢性光损伤HDFs诱导组(即UVA+MOP组)几乎所有细胞均出现体积变大、细胞颗粒增加等细胞老化的特征性改变;SA-β-Gal染色细胞的阳性率>95%。结论:UVA单次照射可成功建立HDFs急性光损伤模型,UVA联合8-MOP构建HDFs慢性光损伤模型。; 侯巍郑跃许庆芳刘晨陆春赖维; 关键词：光老化皮肤成纤维细胞

MAPK信号通路调控长波紫外线诱导的皮肤成纤维细胞组织蛋白酶K表达被引量：5: 2014年; 目的研究MAPK信号通路调控长波紫外线（UVA）诱导皮肤成纤维细胞组织蛋白酶K（CatK）的表达.方法原代培养的皮肤成纤维细胞取自儿童包皮.Western印迹检测10 J/cm^2 UVA照射前及照射后0.75、1.5、3和6h皮肤成纤维细胞中磷酸化JNK（p-JNK）、JNK、磷酸化P38（p-P38）、P38蛋白的表达.800 nmol/L SP600125（SP）、10 μmol/L SB203580（SB）分别孵育皮肤成纤维细胞,实验分为无UVA照射的对照组、SP组、SB组及10 J/cm^2 UVA照射的对照（UVA）组、UVA-SP组、UVA-SB组.先以Western印迹检测各组UVA照射后1.5 h磷酸化c-Jun （p-c-Jun）和磷酸化MAPKAPK2 （p-MAPKAPK2）表达,再以RT-PCR和Western印迹检测各组照射后48 h CatK mRNA、蛋白的表达.结果皮肤成纤维细胞在UVA照射后0.75、1.5 h,p-JNK表达的灰度值分别为4.77±0.19和4.68土0.09,p-P38分别为2.44±0.13、2.30±0.04,均较照射前（p-JNK为3.2±0.27,p-P38为1.61±0.08）显著升高（均P＜0.05）;而在照射后3、6h的表达与照射前相比差异无统计学意义（P＞0.05）.p-c-Jun在UVA-SP组表达（2.55±0.48）、p-MAPKAPK2在UVA-SB组表达（1.16±0.12）均显著低于UVA组（分别为4.85±0.96和2.46±0.09）,均P＜0.05.UVA-SP组、UVA-SB组CatK mRNA、蛋白的表达分别降为UVA组的38.9％、28.7％和55.7％、49.6％（P＜0.05）,UVA-SP组CatKmRNA、蛋白的表达也均显著低于UVA-SB组（P＜0.05）.结论 JNK和P38信号通路在调控UVA上调的皮肤成纤维细胞CatK表达中起重要作用.; 许庆芳侯巍郑跃刘晨龚子鉴陆春赖维; 关键词：成纤维细胞组织蛋白酶类 MAP激酶信号系统紫外线

连续长波紫外线照射对人皮肤成纤维细胞胞吞、降解弹性蛋白的影响被引量：1: 2015年; 目的：研究连续长波紫外线（UVA）照射对人皮肤成纤维细胞胞吞和胞内降解细胞外弹性蛋白能力的影响，探讨光老化皮肤弹性蛋白堆积的机制。方法将人皮肤成纤维细胞分为空白对照组和连续 UVA照射组，连续 UVA 照射组予连续7 d 每天9.9 J/cm^2 UVA 照射以构建人皮肤成纤维细胞慢性光损伤模型。用流式细胞仪和衰老相关β半乳糖苷酶染色法分别检测细胞周期和细胞老化程度以验证模型。用荧光示踪技术和共轭淬灭技术，比较两组细胞对培养基中弹性蛋白的胞吞情况和对胞吞进入细胞的弹性蛋白的降解情况差异。结果与空白对照组相比，连续 UVA 照射组 G1期细胞比例和衰老细胞比例明显增高，人皮肤成纤维细胞慢性光损伤模型构建成功。空白对照组人皮肤成纤维细胞在与弹性蛋白共孵育24、48、72 h 后对弹性蛋白的胞吞率依次为（10.0±1.4）%、（27.8±4.2）%、（39.9±4.1）%，连续 UVA 照射组人皮肤成纤维细胞在对应时间点的胞吞率依次为（9.9±1.6）%、（28.3±5.1）%、（42.0±5.7）%，在相同时间点两组细胞对弹性蛋白的胞吞率差异均无统计学意义（均 P 〉0.05）。空白对照组人皮肤成纤维细胞在与弹性蛋白共孵育24、48、72 h 后，胞内降解内吞入胞的弹性蛋白的细胞百分率依次为（7.7±0.9）%、（22.8±1.8）%、（33.9±3.1）%，而连续 UVA 照射组人皮肤成纤维细胞在对应时间点依次为（4.2±1.1）%、（16.5±2.4）%、（26.7±2.6）%，均较对照组显著降低（均 P 〈0.05）。结论连续7 d 每日9.9 J/cm^2 UVA 照射对人皮肤成纤维细胞胞吞弹性蛋白的能力没有明显影响，却使细胞对胞吞的弹性蛋白的胞内降解能力下降。; 刘晨赖维许庆芳侯巍郑跃吴琳王宇键; 关键词：成纤维细胞皮肤衰老紫外线弹性蛋白蛋白水解

长波紫外线对皮肤成纤维细胞表达和分泌组织蛋白酶G的影响被引量：1: 2014年; 目的研究长波紫外线（UVA）照射对皮肤成纤维细胞组织蛋白酶G（CatG）表达和分泌的影响.方法原代培养的皮肤成纤维细胞来自儿童包皮,10代以内的细胞行后续实验.①以10 J/cm2 UVA照射皮肤成纤维细胞,24、48、72 h后提取照射组和对照组细胞蛋白和mRNA,并收集细胞上清液;②分别以10、20、30 J/cm2UVA照射皮肤成纤维细胞,24 h后收集细胞和上清液.用RT-PCR和Western印迹分别检测各组细胞CatGmRNA及蛋白的表达,ELISA检测细胞上清液CatG的含量.结果 10 J/cm2 UVA照射后24、48、72 h,照射组细胞CatG mRNA表达分别为0.376±0.014、0.308±0.022和0.296±0.032,对照组分别为0.183±0.003、0.185±0.005、0.182±0.004;照射组细胞CatG蛋白灰度值分别为1.80±0.12、1.41±0.17和1.27±0.09,对照组分别为0.96±0.06、0.95±0.22、1.00±0.14;照射组细胞CatG mRNA、蛋白表达及细胞上清液CatG含量较相应的对照组升高（均P＜ 0.05）,且以照射后24h表达最高.10、20、30 J/cm2 UVA照射后24 h,皮肤成纤维细胞CatG mRNA表达分别为对照组的1.90、2.51、3.04倍,细胞CatG蛋白表达分别为对照组的1.88、3.97、4.72倍,细胞上清液CatG含量分别为对照组的1.36、1.50、1.66倍,均随UVA剂量的升高而增加,其差异有统计学意义（均P＜ 0.01）.结论急性UVA照射促进皮肤成纤维细胞表达和分泌CatG.; 许庆芳侯巍赖维郑跃刘晨陆春; 关键词：成纤维细胞组织蛋白酶类紫外线细胞衰老

组织蛋白酶B在急性光损伤皮肤成纤维细胞中的表达及意义被引量：5: 2014年; 目的探讨组织蛋白酶B（CatB）在急性光损伤人皮肤成纤维细胞（HDF）中的表达变化及意义.方法体外培养原代HDF,选取第4～8代细胞进行实验.实验设长波紫外线（UVA）照射组和不照射的对照组.CCK8法分别检测5、10、15、20和25 J/cm2 UVA照射后HDF的增殖率.用10 J/cm2 UVA单次照射致HDF急性光损伤,Western印迹及实时定量逆转录（RT）-PCR分别检测急性光损伤组HDF及对照组HDF照射后24、48、72 h CatB蛋白及mRNA表达;另外分别用10、15、20、25 J/cm2 UVA照射HDF,Western印迹及实时定量RT-PCR分别检测急性光损伤组及对照组HDF照射后48 h CatB蛋白及基因表达.数据采用SPSS 13.0统计软件行方差分析,两组间比较采用最小显著差异法（LSD）.结果 UVA照射导致HDF增殖率下降;当UVA剂量≤10 J/cm2时,细胞存活率均保持在85％以上,各照光组分别与对照组24、48、72 h时比较,均P＜0.05.Western印迹结果显示,急性光损伤组（10 J/cm2 UVA照射）CatB蛋白灰度值在照射后24 h（0.76±0.14）、48 h（1.34±0.38）、72 h（0.82±0.09）均较对照组（分别为0.35±0.01、0.45±0.12、0.61±0.06）升高（均P＜0.05）.实时定量RT-PCR显示,在急性光损伤组CatB的mRNA表达在照射后24 h（0.149±0.009）、48 h（0.173±0.009）、72 h（0.185±0.158）也较对照组（分别为0.089±0.015、0.091±0.010、0.111±0.017）上调（均P＜0.05）.10、15、20、25 J/cm2 UVA照射HDF后48 h,CatB的蛋白灰度值分别为0.99±0.07、1.49±0.14、1.89±0.08、2.07±0.06,均较对照组（0.60±0.05）升高（均P＜0.05）,CatB的mRNA表达也较对照组升高.结论 UVA致急性光损伤的皮肤成纤维细胞中CatB蛋白及mRNA表达均上调.; 侯巍许庆芳刘晨郑跃赖维; 关键词：成纤维细胞紫外线组织蛋白酶B

UVA照射对皮肤成纤维细胞组织蛋白酶K表达的影响被引量：6: 2013年; 目的探讨皮肤成纤维细胞中组织蛋白酶K（Cathepsin K，CatK）的表达随UVA照射后时间及其剂量的变化。方法原代培养的皮肤成纤维细胞来自儿童包皮，10代以内的细胞行后续实验。先以10J／em2UVA照射皮肤成纤维细胞，在照射后24、48、72h提取照射组和对照组细胞蛋白和mRNA。再以10J／cm2、20J／cm2、30J／cm2UVA照射皮肤成纤维细胞，在照射后48h收集细胞。用RT—PCR和Western印迹法分别检测各组间CatKmRNA、蛋白的表达的差异。结果10J／cm2UVA照射后1、2、3d，照射组CatKmRNA表达分别为0．351±0．038（对照组0．177±0．006）、0．510±0．017（对照组0．176±0．002）、0．313±0．012（对照组0．173±0．002）。照射组CatK蛋白灰度值分别为1．76±0．27（对照组0．82±0．45）、2．97±0．36（对照组1．58±0．15）、2．23±0．14（对照组1．29±0．32），照射组CatKmRNA、蛋白表达均较对照组升高（P〈0．05），且以照射后第2天表达最高。10、20、30J／cmzUVA照射后，48h皮肤成纤维细胞中CatKmRNA表达分别为对照组的2．34、2．91、3．18倍，CatK蛋白表达分别为对照组的1．77、2．82、3．64倍，均随UVA剂量的升高而增加，其差异有统计学意义（P〈0．05）。结论CatK在UVA照射后皮肤成纤维细胞中的表达升高。; 许庆芳侯巍刘晨郑跃龚子鉴赖维; 关键词：成纤维细胞组织蛋白酶K 紫外线

SP600125抑制UVA激活皮肤成纤维细胞JNK通路的最佳浓度被引量：3: 2014年; 【目的】研究抑制UVA激活的皮肤成纤维细胞JNK通路的最佳SP600125浓度,为研究JNK信号通路在光老化中的作用机制奠定基础。【方法】原代培养取自儿童包皮的皮肤成纤维细胞。用CCK-8法结合荧光倒置显微镜研究不同剂量UVA和不同浓度SP600125及两者联合对皮肤成纤维细胞活性和形态的影响,以选择非细胞毒性的UVA剂量和SP600125浓度。再用Western-blot检测UVA辐照后不同时间点皮肤成纤维细胞中磷酸化c-Jun(P-c-Jun)表达以确定其被诱导表达的时间点。最后用Western-blot检测不同浓度SP600125对UVA上调的P-c-Jun表达的抑制。【结果】UVA和SP600125分别辐照细胞和孵育细胞时,UVA≤10 J/cm2和SP600125≤2μmol/L均能保持细胞活性在90%以上。10 J/cm2的UVA辐照不同浓度SP600125孵育的细胞时,≤800 nmol/L的SP600125孵育的细胞活性在90%以上;1μmol/L的SP600125使细胞活性明显下降至67.1%,镜下见部分细胞皱缩、碎裂、死亡;2μmol/L的SP600125使细胞活性进一步下降至7.6%,镜下见绝大部分细胞变形、碎裂、死亡。Western-blot结果显示P-c-Jun在UVA辐照后0.75 h、1.5 h均较0 h升高,3 h后恢复至0 h水平。200~800 nmol/L SP600125呈剂量依赖性地抑制UVA上调的P-c-Jun表达,差异有统计学意义。【结论】低于常用浓度的200~800 nmol/L SP600125即可抑制UVA激活的皮肤成纤维细胞的JNK通路。JNK通路可能在UVA辐照的皮肤成纤维细胞中起抗凋亡作用。; 许庆芳侯巍郑跃刘晨龚子鉴陆春赖维; 关键词：SP600125 UVA 皮肤成纤维细胞光老化

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国家自然科学基金(81171523)

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