国家自然科学基金(81171534)
- 作品数：8 被引量：5H指数：1
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- 相关机构：浙江大学杭州医学院浙江中医药大学附属第一医院更多>>
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- 钩端螺旋体外膜蛋白 Loa22优势 T-B联合抗原表位及其免疫原性研究被引量：1
- 2015年
- 目的：筛选并鉴定致病性问号钩端螺旋体（简称钩体）外膜蛋白Loa22优势T细胞和B细胞（ T／B）联合抗原表位及其免疫原性。方法采用PCR检测我国流行的8群8型株问号钩体loa22基因，T-A克隆后测序。构建问号钩体黄疸出血群赖型赖株loa22基因原核表达系统。 Ni-NTA亲和层析法提纯表达的目的重组蛋白rLoa22并制备其兔抗血清及其IgG。采用生物信息学软件预测Loa22的T-B联合抗原表位。采用噬菌体展示联合Western blot法、ELISA分别检测重组噬菌体PⅢ蛋白展示的T-B联合表位肽和人工合成T-B联合表位肽的免疫原性。采用MTS法和ELISA分别检测T-B联合表位肽诱导T细胞活化及其分泌IL-2、IL-4和IFN-γ情况。结果所有受检的致病性钩体株均能检出loa22基因，其核苷酸和氨基酸序列相似性高达85．5％～99．8％和93．9％～99．5％。所构建的loa22基因原核表达系统能高效表达rLoa22。 Loa22-77、Loa22-90、Loa22-125和Loa22-157这4个T-B联合抗原表位中，仅有Loa22-90显示了很强的Western blot阳性条带。 Loa22-90能有效诱导CD4＋T细胞增殖及IL-2（Th1）和IL-4（Th2）水平显著升高（P＜0．05）。结论 Loa22是问号钩体序列保守的属特异性外膜蛋白抗原，其优势T-B联合抗原表位为Loa22-90，该表位可作为钩端螺旋体多抗原肽疫苗的候选表位。
- 阮萍赵金方李阳严杰胡玮琳
- 关键词：钩端螺旋体外膜蛋白免疫原性
- 钩端螺旋体毒性蛋白VapC核酸酶活性及其对宿主细胞毒性作用的研究被引量：1
- 2012年
- 目的了解钩端螺旋体毒素一抗毒素系统中毒性蛋白VapC的功能及其对宿主细胞的毒性作用。方法以致病性问号钩体黄疸出血群赖型赖株基因组DNA为模板，采用PCR扩增全长vapB、vapC、vapBC基因并构建其原核表达系统。采用SDS—PAGE检测目的重组蛋白rYapB和rVapC表达情况，Ni-NTA亲和层析柱提纯rVapB和rVapC。检测rVapB和rVapC有无水解问号钩体赖株及THP．1细胞DNA或RNA活性。分别采用实时荧光定量PCR和Westernblot试验，检测问号钩体赖株感染THP．1细胞前后vapB和vapC基因转录及表达水平的变化。构建vapB和vapC基因真核表达载体并转染细胞，采用CCK-8试剂检测VapB和VapC蛋白对细胞活性的影响。结果所克隆的vapB和vapC基因核苷酸及氨基酸序列与文献报道完全相同。所构建的原核表达系统能分别表达rVapB和rVapC。rVapC可水解RNA，但不水解DNA。问号钩体赖株感染THP-1细胞后，vapB和vapC基因转录及表达水平均显著上调，部分毒性蛋白VapC外分泌。转染vapC基因的人肾小管上皮细胞HEK293大量死亡。结论问号钩体赖株VapC蛋白为RNA酶，可在感染宿主细胞过程中外分泌并对细胞有明显毒性。
- 辛晓阳林旭瑷李立伟严杰
- 关键词：致病性钩端螺旋体毒素-抗毒素系统细胞毒性
- 问号钩端螺旋体磷脂酶C鉴定及其诱导巨噬细胞凋亡机制
- 2013年
- 目的：确定问号钩端螺旋体（简称钩体） LB361基因产物磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C （ phosphatidylinositol phospholipase C ，L-PI-PLC）功能及其诱导巨噬细胞凋亡的作用与机制。方法采用生物信息学技术分析问号钩体赖型赖株LB361基因序列中PI-PLC结构功能域。采用原核表达系统表达该基因产物（ rL-PI-PLC）。采用IP3荧光偏振试验了解rL-PI-PLC水解PIP2底物产生IP3的活性。采用实时荧光定量RT-PCR及Western blot法分别检测问号钩体赖株感染人THP-1巨噬细胞时LB361基因转录、表达及分泌情况。构建LB361基因转染THP-1细胞株，分别采用激光共聚焦显微镜法和流式细胞术，检测LB361基因产物THP-1通过IP3引起内质网钙释放，从而导致细胞胞内游离钙离子浓度（[ Ca2＋] i）升高并诱导细胞凋亡的作用。结果 rL-PI-PLC能水解PIP2产生IP3，其Km和Kcat值分别为199μmol/L和8．566×10-5 S-1。问号钩体赖株感染THP-1细胞后，LB361-mRNA及L-PI-PLC蛋白表达水平显著升高并外分泌。与未转染正常细胞比较，LB361基因转染THP -1细胞中IP3浓度及[ Ca2＋] i明显升高，从而引起部分 THP-1细胞发生[ Ca2＋] i 依赖性凋亡。结论问号钩体LB361基因产物是磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C，该酶在问号钩体感染巨噬细胞过程中可引起[ Ca2＋] i升高而导致细胞凋亡。
- 张金良赵金方楼宏强林旭瑷严杰孙爱华
- 关键词：问号钩端螺旋体巨噬细胞
- 整合素和钙通道在人与小鼠钩端螺旋体主要宿主细胞上分布的差异
- 2012年
- 目的:了解人和小鼠钩端螺旋体(简称钩体)主要宿主细胞上整合素与钙通道表达情况及其差异。方法:采用免疫荧光和Western blot法,检测人单核细胞株THP-1、小鼠单核!巨噬样细胞株J774A.1、人脐静脉内皮细胞株HUVEC、小鼠血管内皮细胞株EOMA、人肝细胞株L-02、小鼠肝细胞株Hepa1-6、人肾小管上皮细胞株HEK-293、小鼠肾小球系膜上皮细胞株SV40-MES13、小鼠肾成纤维细胞株NIH/3T3、人及小鼠血小板的β1、β2、β3类整合素分子以及Cav3.1、Cav3.2、Cav3.3、Cav2.3电压门控型钙通道蛋白和P2X1、P2X2、P2X3、P2X4、P2X5、P2X6、P2X7受体门控型钙通道蛋白的分布差异。结果:整合素β1分子表达于J774A.1、THP-1、HUVEC、EOMA、L-02、Hepa1-6、HEK-239细胞以及人和小鼠血小板膜表面,β2分子表达于J774A.1、THP-1、HUVEC、EOMA和NIH-3T3细胞膜表面,β3分子表达于J774A.1、THP-1、HUVEC、EOMA、Hepa1-6、HEK-239、NIH-3T3细胞以及人和小鼠血小板膜表面。ATP依赖性受体门控型钙通道蛋白P2X1表达于人和小鼠血小板膜表面,P2X5表达于J774A.1、THP-1、L-02、Hepa1-6、HEK-239和HUVEC细胞膜表面,但未检测出上述细胞或血小板表达其它钙通道蛋白。结论:不同种类整合素分子和钙通道蛋白在钩体主要宿主细胞上表达明显不同,这可能与钩体对不同组织细胞致病性差异有关。
- 李成学赵欣钱景严杰
- 关键词：钩端螺旋体宿主细胞整合素
- 问号钩端螺旋体MazF蛋白对巨噬细胞的毒性作用分析被引量：1
- 2013年
- 目的了解问号钩端螺旋体（简称钩体）MazEF毒素-抗毒素系统中MazF蛋白对巨噬细胞的细胞毒性及其机制。方法采用原核表达系统表达问号钩体赖型赖株MazEF毒素-抗毒素系统中的MazE和MazF蛋白（rMazE和rMazF）。采用DNA和RNA降解试验确定rMazF的DNA或RNA酶活性以及rMazE抑制rMazF酶活性的作用。采用实时荧光定量RT-PCT、Westernblot和激光共聚焦显微镜法，分别检测问号钩体赖株感染THP-1单核细胞时mazE和mazF基因转录、表达及分泌情况。采用CCK-8法和流式细胞术检测mazF基因产物对THP-1细胞的细胞毒性及死亡方式。结果rMazF能水解问号钩体赖株和THP-1细胞的RNA，但无DNA酶活性，rMazE能抑制rMazF的RNA酶活性。感染THP-1细胞后，mazE-mRNA和mazF-mRNA及MazE和MazF蛋白表达水平显著升高，但仅有MazF蛋白外分泌。mazF基因产物对THP-1细胞有细胞毒性并引起细胞坏死。结论MazEF毒素-抗毒素系统中具有RNA酶活性的MazF蛋白是问号钩体的毒力因子，可引起感染的巨噬细胞坏死。
- 张金良Komi-Koukoura Komi楼宏强林旭瑷严杰孙爱华
- 关键词：问号钩端螺旋体毒素-抗毒素系统细胞毒性
- 钩端螺旋体vwA1和vwA2基因原核表达产物功能的初步研究被引量：1
- 2012年
- 目的构建致病性问号钩端螺旋体（简称钩体）黄疸出血群赖型赖株伽A1和优以2基因原核表达系统，初步了解目的重组表达产物rVwA1和rVwA2与血小板性出血相关性。方法采用高保真PcR扩增问号钩体赖株vwA1和vwA2基因并测序，常规方法构建伽A1和似值2基因原核表达系统。采用sDs-PAGE联合Bio—Rad凝胶图像分析系统检查rVwAl和rVwA2表达情况及其可溶性，Nj-NTA亲和层析柱提纯rVwA1和rVwA2。采用实时荧光定量RT—PcR检测问号钩体赖株感染人脐静脉内皮细胞株HuVEc前后vwA1—mRNA和vwA1-mRNA水平变化。采用流式细胞术检测rVwA1与人血小板膜糖蛋白结合能力。采用酶切试验及SDs-PAGE观察人血管性血友病因子裂解酶ADAMTs13水解rVwA2的情况。结果所克隆的钩体vwA1和vwA2基因与报道的相应基因比较，其核苷酸和氨基酸序列相似性均为100％。所构建的vwA1和vwA2基因原核表达系统能分别表达可溶性rVwAl和rVwA2。问号钩体赖株感染HuVEc8h后，钩体vwA1-mRNA和vwA2-mRNA水平均显著上调（P〈0．05）。流式细胞术检测结果显示，钩体rVwA1与人血小板结合率为60．8％。人ADAMTS13可水解重组人vwF—A2（rhvwF—A2），但不能水解钩体rVwA2。结论vwA1和vwA2基因可能在钩体感染中发挥作用，其中vwA1基因产物功能与钩体病出血密切相关。
- 邱文娜楼永良严杰孙爱华
- 关键词：问号钩端螺旋体原核表达
- 问号钩端螺旋体colA基因产物胶原酶活性及其致病机制研究
- 2016年
- 目的了解不同问号钩端螺旋体(简称钩体)血清群colA基因分布和序列保守性、表达产物胶原酶活性以及感染细胞时colA基因表达水平变化和产物分泌情况。方法采用PCR及其产物测序法检测我国主要流行的7个问号钩体血清群代表株中colA基因并了解其序列保守性。构建问号钩体黄疸出血群赖型赖株colA基因原核表达系统,Ni-NTA亲和层析法提取表达的目的重组蛋白rColA。采用分光光度法检测rColA水解I^IV型天然胶原蛋白及Azocoll和Pz-肽合成底物能力并测定其Km和Kcat值。采用实时荧光定量RT-PCR和Western Blot分别检测问号钩体赖株感染HUVEC、BEAS-2B、L-02、HEK293细胞时colA-mRNA水平变化及ColA分泌情况。结果不同血清群问号钩体均能扩增出全长colA基因片段,其核苷酸和氨基酸序列相似性高达99.4%~100%。所构建的colA基因表达系统能有效表达rColA。rColA能不同程度地水解上述6种底物,但水解III型胶原蛋白能力最强(P<0.05),其Km和Kcat值分别为2.16mg/mL和35.6h-1。问号钩体赖株感染各靶细胞时colA-mRNA水平显著升高(P<0.01),问号钩体-细胞共培养物上清中可检出ColA。结论问号钩体colA基因为序列保守、分布广泛的胶原酶编码基因,感染细胞时该基因产物表达上调并外分泌,从而在问号钩体感染宿主过程中发挥实际作用。
- 赵金方谈潘莉汪浙炯胡玮琳严杰Kokouvi Kassegne
- 关键词：问号钩端螺旋体胶原酶
- 钩端螺旋体 LPS 和外膜蛋白诱导巨噬细胞凋亡及其与 Fas／FasL 相关性研究被引量：1
- 2014年
- 目的：了解致病性问号钩体螺旋体（简称钩体）脂多糖（ L-LPS）和外膜蛋白（ L-OMP）诱导J774A．1小鼠巨噬细胞死亡及其与Fas/FasL相关性。方法分别采用酚水法和Triton X-114法从问号钩体黄疸出血群赖型赖株中提取L-LPS和L-OMP。采用流式细胞术检测紫外线灭活前后问号钩体赖株、多黏菌素B（PMB）处理前后L-LPS、蛋白酶K（PK）作用前后L-OMP诱导J774A．1细胞凋亡及坏死情况。采用siRNA沉默J774A．1细胞Fas或FasL基因并用实时荧光定量RT-PCR检测靶基因沉默效果。采用流式细胞术测定L-LPS或L-OMPs诱导Fas或FasL基因沉默J774 A．1细胞凋亡的作用。结果紫外线灭活前后问号钩体赖株可引起相似的J774A．1细胞早期凋亡率（55．6％和47．1％）和晚期凋亡/坏死率（7．9％和7．6％）。100 ng L-LPS或100μg L-OMP作用1×10^5 J774A．1细胞4 h后，早期凋亡率和晚期凋亡/坏死率分别为40．4％和34．0％、7．5％和6．9％，但等量PMB预处理L-LPS或PK预处理L-OMP诱导细胞凋亡或坏死的作用消失。 Fas或FasL基因沉默后，L-LPS诱导的J774A．1细胞早期凋亡率均显著下降（P＜0．05），L-OMP仅使Fas基因沉默J774A．1细胞早期凋亡率有所下降（P＜0．05）。结论 L-LPS和L-OMP可诱导Fas/FasL相关巨噬细胞凋亡，从而有利于问号钩体在宿主体内建立有效感染。
- 杜蓬刘小香严杰葛玉梅孙爱华
- 关键词：问号钩端螺旋体外膜蛋白
