国家自然科学基金(30872242)
- 作品数：5 被引量：16H指数：3
- 相关作者：张继明李新艳毛日成翁心华刘红艳更多>>
- 相关机构：复旦大学上海市第七人民医院复旦大学上海医学院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金国家高技术研究发展计划上海市基础研究重大（重点）项目更多>>
- 相关领域：医药卫生更多>>
- 阿德福韦耐药乙型肝炎病毒毒株生物学特性的研究被引量：4
- 2009年
- 目的体外研究阿德福韦（ADV）耐药相关变异对于HBsAg产生及HBV复制等生物学特性的影响。方法收集12例在ADV治疗过程中出现病毒学突破的慢性乙型肝炎患者血清，对其HBV反转录（RT）区进行PCR扩增和测序分析。对其中4例患者的HBV进行全基因扩增、测序、序列分析及克隆。将优势株的HBV全基因插入PHY106载体，构建成1．1拷贝HBV基因组表达载体，进而转染Huh7细胞，E1．ISA法检测细胞培养上清液中HBsAg及HBeAg水平，了解不同ADV耐药相关变异类型对HBsAg分泌的影响。抽提转染细胞内病毒核心颗粒HBVDNA，实时荧光定量PCR方法检测HBVDNA水平。将rtA181T／sW172＊变异株与rtA181非变异株质粒按不同比例混合，共转染Huh7细胞，检测上清液中HBsAg及细胞内病毒核心颗粒HBVDNA水平。结果在12例出现病毒学突破的患者中，10例出现ADV耐药相关位点变异，以rtA181变异为主，其中5例有rtA181T变异，4例为rtA181T／s＋rtN236T变异。将含rtA181T／sW172＊变异的质粒转染细胞后，上清液中不能检测到HBsAg，而含其他变异类型的质粒转染细胞后，上清液中HBsAg和细胞内病毒核心颗粒HBVDNA水平与非变异株相似；含不同变异的HBV临床分离株转染后的细胞内核心病毒颗粒HBVDNA水平未见明显差异。将rtA181T／sW172＊变异株及rtA181非变异株的质粒共转染后，随着rtA181非变异株比例的增加，上清液中HBsAg水平也逐渐增高，但细胞内核心病毒颗粒HBVDNA水平无明显差异。结论rtA181变异是ADV耐药相关性变异的主要类型，rtA181T变异较多见。rtA181T／sW172＊变异株可引起HBsAg分泌障碍，但rtA181非变异株可纠正rtA181T／sW172＊变异株的HBsAg分泌障碍。不同类型的ADV耐药相关变异对HBV的复制能力无显著影响。
- 李新艳尹有宽张继明毛日成马张妹翁心华
- 关键词：阿德福韦腺嘌呤病毒复制转染
- 乙型肝炎病毒对核苷(酸)类似物耐药的研究进展被引量：6
- 2009年
- 在过去10余年里,口服核苷(酸)类似物的应用使慢性乙型肝炎的治疗取得很大进展。长期核苷(酸)类似物治疗的主要缺陷是乙型肝炎病毒(HBV)耐药性的产生,后者可致所获得的疗效丢失,有时可导致肝炎活动、甚至死亡。本文主要介绍HBV耐药的发生机制、相关定义、发生率、处理及预防策略等。
- 张继明
- 关键词：核苷(酸)类似物乙型肝炎病毒耐药
- 应用滚环扩增技术检测乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA的研究被引量：5
- 2010年
- 目的 应用滚环扩增（RCA）技术检测HBV共价闭合环状DNA（cccDNA）,观察该方法的特异性和敏感性.方法 以HBV全基因质粒为模板,经酶切、连接、浓缩、胶回收纯化等步骤,构建和制备HBV cccDNA标准品.抽提7例慢性乙型肝炎患者肝组织总DNA,进行滚环扩增.用HBV cccDNA标准品、3.2 kb线性HBV DNA、健康肝组织总DNA及15例慢性乙型肝炎患者血清总DNA作为对照,验证此方法的特异性.将HBV cccDNA标准品进行系列稀释,了解该方法的敏感性.结果 成功构建了HBV cccDNA,并可用RCA方法进行扩增.RCA方法可从2 mg的慢性乙型肝炎患者肝组织中检测到HBV cccDNA,并可检测低至1×102拷贝/μL的HBV cccDNA.RCA方法不能检测3.2 kb线性HBV DNA,在健康肝组织及15例慢性乙型肝炎患者血清中亦检测不到HBV cccDNA.结论 RCA方法操作较方便,具有很高的特异性和敏感性.
- 赵旭刘红艳李新艳秦艳丽邬祥惠翁心华佘会元张继明
- 应用PCR-RFLP技术检测乙型肝炎病毒变异rtI233V
- 2009年
- 目的建立一种应用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)分析技术检测乙型肝炎病毒(HBV)变异rtI233V的方法。方法参照GenBank收录的HBV基因逆转录(RT)区序列设计PCR引物,根据HBVRT区rt233位野生型和变异型的序列,分别选择Bst1107I和Bsp1407I两种内切酶。以rtI233V变异株及野毒株质粒为模板进行PCR扩增,PCR产物分别用Bst1107I和Bsp1407I两种限制性内切酶进行酶切,观察酶切产物琼脂糖凝胶电泳条带变化。并以变异型和野生型质粒的不同配比,分析该检测方法的敏感性。结果本研究建立的PCR-RFLP方法可同时检测野毒株和rtI233V变异株。PCR扩增后,野毒株和rtI233V变异株的PCR产物长度均为255bp。以Bst1107I酶切,野毒株质粒的PCR产物可以切成75bp和180bp两段,rtI233V变异株PCR产物的长度保持不变。以Bsp1407I酶切,rtI233V变异株质粒的PCR产物可以切成75bp和180bp两段,野毒株质粒的PCR产物长度保持不变,测序结果与上述结果一致。敏感性检测表明,此方法至少可检出标本中10%的变异株。应用此方法检测100例慢性乙型肝炎患者,筛选出2例rtI233V变异患者。结论应用PCR-RFLP方法可检测rtI233V变异,具有较高的敏感性,可用于HBV变异rtI233V的早期诊断。
- 郭红英李新艳毛日成尹有宽张继明
- 关键词：乙型肝炎病毒聚合酶链式反应限制性片段长度多态性
- 应用液相芯片技术检测拉米夫定耐药相关性HBV变异被引量：1
- 2009年
- 目的建立一种检测拉米夫定（LAM）耐药相关性HBV变异的检测系统。方法从血清样本中提取病毒DNA，经纯化后，与生物素标记的引物经过PCR扩增后，来自HBV开放阅读框架的、被生物素标记的DNA扩增产物与偶联在微球上的特异性寡核苷酸探针杂交，未能结合微球的DNA被洗脱，加入标记有链亲素修饰的藻红蛋白（SAPE），在Luminex分析仪上，用双色激光分别激发微球的红色荧光（定性）和SAPE的绿色荧光（定量），从而判断靶基因的突变类型和相对含量。采用液相芯片（muhi-analyte suspension array，MASA）技术构建有LAM相关耐药的HBV全基因质粒和25例LAM耐药的慢性乙型肝炎患者（CHB）的HBV逆转录区（RT）第180和204位氨基酸的变异情况；并与普通测序法相比较，以了解该方法的特异性；同时将变异株和野毒株按不同比例混合后检测，以了解该方法的敏感性。结果MASA可同时检测a180和n204氨基酸变异，并能准确判断变异的类型及混合变异；MASA对25例LAM耐药的CHB患者相关耐药，检测发现有15份患者标本中20411探针杂交信号明显升高（测序变异阴性和阳性荧光值中位数分别为5和106），有11份样本与204V探针杂交信号较高（测序变异阴性和阳性荧光值中位数分别为9和114）差异有统计学意义（z=-4．588，P〈0．05；z=-4．520，P〈0．05）；有2份发现2种探针杂交信号均很高，即有YIDD和YVDD混合变异株存在；仅有1份标本与20412探针杂交信号明显较高。同样用该方法检测20份未治疗患者的血清标本，均未发现LAM相关性变异。当病毒群中含有大于5％的LAM耐药相关HBV变异株时，即可被本方法检测到。结论MASA可用于LAM相关耐药变异株的早期检测。该方法较普通测序法灵敏，且操作简便、高通量、需要时间短，便于临床大样本检测的应用。
- 刘红艳毛日成李义良夏佳慧范丽丽尹永喜李新艳赵旭郭红英朱浩翔张继明
- 关键词：拉米夫定芯片分析技术
