国家自然科学基金(U0931003L01)
- 作品数：4 被引量：6H指数：2
- 相关作者：周恩民孔宁高继明赵钦肖一红更多>>
- 相关机构：西北农林科技大学山东农业大学更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金国家高技术研究发展计划陕西省科技攻关计划更多>>
- 相关领域：农业科学生物学医药卫生更多>>
- 猪波形蛋白对PRRSV感染Marc-145细胞的抑制作用被引量：3
- 2012年
- 为了研究波形蛋白在介导猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染细胞过程中的作用,利用RT-PCR方法从PRRSV非易感细胞系猪肾细胞系PK-15细胞中扩增目的基因,克隆入pET-28a(+)载体,转化大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达。表达的重组猪波形蛋白经SDS-PAGE和Western blot鉴定和纯化后免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体。利用病毒抑制试验检测重组猪波形蛋白及多克隆抗体在PRRSV感染Marc-145细胞过程中的作用。结果表明,成功扩增猪波形蛋白基因并克隆入pET-28a载体,经诱导后得到高效表达,纯化后免疫兔子产生高价血清抗体(105)。病毒阻断结果表明,猪波形蛋白及多克隆抗体均能阻断PRRSV感染Marc-145细胞。这为以波形蛋白为基础的PRRSV受体阻断抑制剂的研究提供了实验依据。
- 马晓春孔宁高继明王彤彤黄柏成赵钦肖一红周恩民
- 关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒波形蛋白病毒抑制受体阻断
- 关中黑猪IL-5 cDNA的克隆表达与多克隆抗体制备被引量：1
- 2013年
- 目的克隆关中黑猪IL-5 cDNA,构建该基因的不同表达质粒,获得表达的IL-5并制备其多克隆抗体。方法提取佛波酯(PHA)刺激的关中黑猪外周血单个核细胞(PBMC)总RNA,RT-PCR克隆猪IL-5基因(sIL-5),鉴定后将sIL-5基因分别克隆到pQE30、pET-32a和pEGFP-N1中,构建重组表达质粒pQE-sIL-5和pET-sIL-5及pEGFP-sIL-5,将pEGFP-sIL-5瞬时转染PK-15细胞,将pQE-sIL-5和pET-sIL-5分别转化JM109和BL21,用1 mmol/L IPTG诱导目的蛋白表达,SDS-PAGE和Western blot法鉴定表达蛋白后,通过镍柱纯化目的蛋白。用纯化的BL21表达的IL-5免疫小鼠,制备其多克隆抗体,用纯化的JM109表达的IL-5通过优化的间接ELISA检测抗体效价。结果成功获得关中黑猪的IL-5基因(登录号KC660157),大小405 bp,与GenBank中猪IL-5参考序列同源性99.75%,仅25位的T变成C,但编码的氨基酸完全相同;荧光显微镜观察发现pEGFP-sIL-5在PK-15细胞中得到表达;SDS-PAGE结果显示JM109表达的目的蛋白的相对分子质量(M_r)约15 000,而BL21表达的目的蛋白M_r约30000,Western blot法检测结果表明,表达的目的蛋白均具有良好的反应原性;免疫小鼠后获得了IL-5的多克隆抗体,抗体效价最高可达1:12 800。结论克隆了关中黑猪IL-5基因片段并成功表达,获得了IL-5的多克隆抗体。
- 穆杨刘园园李亮亮刘阳尚川川周恩民
- 关键词：IL-5多克隆抗体
- 稳定表达猴源波形蛋白的BHK-21细胞系的建立
- 2012年
- 为建立稳定表达猴源波形蛋白的BHK-21细胞系,采用RT-PCR方法从非洲绿猴肾细胞(Marc-145)中扩增波形蛋白基因,并将其与EmGFP基因、IRES基因共同克隆到pcDNA3.1/V5-His A载体中,成功构建重组质粒pcDNA3.1-GIV。通过非脂质体转染将其转染至BHK-21细胞中,经G418加压筛选,单克隆挑取,获得稳定表达猴源波形蛋白的细胞系BHK-21-GIV。经Western-blot和RT-PCR检测,证明外源波形蛋白成功得到表达。本研究建立的稳定表达猴源波形蛋白的细胞系BHK-21-GIV,为研究波形蛋白的生物学功能及与猪繁殖与呼吸综合征病毒感染细胞的关系提供了有利的工具。
- 马晓春高继明孔宁高丽丽王彤彤肖一红周恩民
- 关键词：波形蛋白稳定细胞系BHK-21细胞猪繁殖与呼吸综合征病毒
- PRRSV细胞受体CD163 SRCR5-SRCR6多克隆抗体的制备被引量：2
- 2014年
- 【目的】制备鼠抗猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）细胞受体CD163 SRCR5-SRCR6多克隆抗体。【方法】提取PAM细胞总RNA，通过RT-PCR方法获得CD163 SRCR5-SRCR6（第1 417～2 136 bp，共720个bp）基因，将其克隆到pET-28a（＋）载体上，构建重组表达载体pET-28a（＋）-CD163，经酶切、PCR鉴定和测序验证后转化大肠杆菌，在BL21（DE3）中诱导重组目的蛋白表达，然后用Ni-NTA方法纯化目的蛋白，免疫Balb/c小鼠制备多克隆抗体，通过间接ELISA和IFA方法检测多克隆抗体效价，并初步鉴定多克隆抗体血清结合细胞及阻断PRRSV感染细胞的活性。【结果】克隆了720 bp的CD163 SRCR5-SRCR6基因，成功构建了pET-28a（＋）-CD163重组表达载体；SDS-PAGE结果表明，CD163 SRCR5-SRCR6重组蛋白被成功诱导并以包涵体形式表达；Western blot结果表明，重组蛋白具有良好的免疫原性，间接ELISA方法测得免疫Balb/c小鼠制备的抗CD163 SRCR5-SRCR6重组蛋白的多克隆抗体效价可达105；IFA试验结果显示，制备的抗CD163 SRCR5-SRCR6重组蛋白的多克隆抗体可与Marc-145细胞结合，且在1∶20、1∶40倍稀释时，能部分阻断高致病性PRRSV SD16毒株感染Marc145细胞。【结论】用大肠杆菌原核表达系统成功诱导表达了CD163 SRCR5-SRCR 6重组蛋白，用重组蛋白免疫小鼠获得了高效价多克隆抗体，其可以结合细胞并阻断PRRSV感染细胞。
- 马玉萍孔宁王向鹏高继明赵钦王承宝周恩民
- 关键词：PRRSV多克隆抗体
