广东省科技攻关计划(2006B20101012)
- 作品数：7 被引量：10H指数：3
- 相关作者：唐冬生蒋泓张细权周天鸿李月琴更多>>
- 相关机构：华南农业大学佛山科学技术学院暨南大学更多>>
- 发文基金：广东省科技攻关计划国家自然科学基金广东省自然科学基金更多>>
- 相关领域：生物学农业科学自然科学总论轻工技术与工程更多>>
- 人工锌指核酸酶诱导的多位点基因打靶的研究
- 引言基因打靶的同源重组发生率很低,难以满足基因打靶的应用要求。锌指核酸酶可以诱导DNA特定位点的双链断裂,从而大大提高同源重组的发生率。本研究小组建立了一种以rRNA基因间的内部转录间隔序列为
- 唐冬生蒋泓曾芳王克振黄永芬梁沂梅张细权
- 关键词：基因打靶锌指核酸酶转基因动物
- 文献传递
- 莱航鸡rDNA重复基因家族的克隆
- 2007年
- 动物rDNA基因是一种GC含量较高、结构复杂的重复序列。通过结合生物信息学技术,经反复摸索后选用LAPCR法扩增莱航鸡rDNA基因重复序列,经测序鉴定最终克隆了莱航鸡的3个rDNA基因及其2个间隔序列。研究对克隆复杂DNA序列时引物设计的特别规则、反应体系的改进、DNA聚合酶的选用、循环参数的调整等进行了探索。
- 唐冬生李芳张勇蒋泓胡大林张细权李月琴周天鸿
- 关键词：RDNA基因基因克隆
- 人工锌指核酸酶的设计与表达纯化
- 2008年
- 设计表达了4个锌指核酸酶,用于切断人基因组中的rRNA基因家族的内部转录间隔序列,造成双链断裂,以此提高针对多位点基因打靶的效率,为后续基因打靶应用于基因治疗研究奠定基础。首先,在人rRNA基因家族ITS1序列中找到2个合适的9 bp长的序列(中间间隔6bp)为锌指蛋白识别位点,根据识别位点序列每个位点分别设计2个三锌指蛋白。通过设计引物进行重叠延伸PCR得到全长编码锌指蛋白的DNA,分别克隆到表达载体pET-28a(+),构建重组质粒pET28a-ZFP,转化大肠杆菌RossettaTM(DE3),实现带组氨酸标签的锌指融合蛋白的表达与纯化。同时,将限制性内切酶FokI的切割结构域分别与4个锌指蛋白序列采用PCR拼接后克隆到表达载体pET-28a(+),构建重组质粒pET28a-ZFN,转化到大肠杆菌RossettaTM(DE3),实现带组氨酸标签的锌指核酸酶融合蛋白的表达并纯化。
- 蒋泓曾芳王克振梁沂梅李月琴张细权周天鸿唐冬生
- 关键词：锌指核酸酶生物合成纯化基因打靶基因治疗
- 人工锌指核酸酶的电子设计与结构模拟
- 2011年
- 以电子设计用于猪的多位点基因打靶的人工锌指核酸酶为例,探索如何电子设计优化理想的人工锌指核酸酶,以减少人工锌指核酸酶的毒性。采用OPEN电子设计方法,生物信息学方法的预测分析ZFP的立体结构,设计优化合适的连接体和间隔体组合,并通过突变优化Fok I异源二聚体。采用OPEN法设计三指ZF序列,并连接为ZFP序列,设计出长度为6 bp且富含AT碱基的spacer,加上长度为4个氨基酸残基的inter-domain linker,连接FokⅠ切割结构域双突变子异源二聚体,并通过各种软件工具对ZFN的空间结构进行模拟预测,所设计得到的ZFN的有效率超过50%。探索获得电子设计理想ZFN的方案,即特异性结合DNA的锌指蛋白、最佳的linker和spacer的长度与组合以及优化的特异性切割的Fok I异源二聚体切割结构域。
- 张勇蒋泓邓廷贤粟文俊杨莉珊唐冬生
- 关键词：锌指核酸酶锌指蛋白连接体
- 锌指蛋白在多位点基因打靶中的应用被引量：1
- 2008年
- 综述了锌指蛋白的功能特性.可以与切割DNA的无特异性切割结构域组成人工锌指核酸酶,可以造成细胞染色质指定序列特异性双链断裂,促使细胞启动重组修复机制,在诱导产生的重组酶的作用下,可以将外源基因片段重组插入染色质的效率提高上万倍。锌指蛋白技术与多位点基因打靶技术相结合,可以在不需药物筛选的情况下,进行人体细胞基因治疗。
- 蒋泓唐冬生
- 关键词：锌指蛋白锌指核酸酶基因打靶基因治疗
- 奶牛胎儿细胞多位点基因打靶的研究被引量：4
- 2008年
- 利用奶牛rDNA基因间的ITS重复序列作为靶位点,对奶牛胎儿成纤维细胞进行多位点基因打靶,建立以重复序列为靶位点的多位点基因打靶技术,并为克隆定点转基因奶牛提供核供体。首先分离培养出奶牛胎儿成纤维细胞,并进行性别鉴定和核型分析。采用MTT比色法确定了G418和GCV正负筛选的最低有效浓度。然后通过多位点基因打靶载体转染、正负筛选获得7个表达绿色荧光的克隆细胞系,经PCR,RT-PCR和测序证实其中1个细胞系为定点整合的克隆细胞系,且GFP基因表达。
- 唐冬生刘广振刘东军蒋泓龚道元马玉珍杨东山梁浩张细权
- 关键词：奶牛胎儿成纤维细胞基因打靶
- 多位点基因打靶的定点整合效率研究被引量：3
- 2009年
- 利用PCR方法从pEGFP-N1中扩增pCMV-EGFP,从人基因组rDNA基因家族靶基因插入位点两侧分别扩增两条基因打靶同源重组引导序列DS1和DS2,将DS1、DS2片段插入pMD19-pCMV-EGFP中,构建成多位点基因打靶载体pMD19-DS2-pCMV-EGFP-DS1。通过脂质体将其转染至HEK293细胞内。通过荧光检测和PCR、测序等方法,检测和评价定点整合效率。试验结果表明,外源基因EGFP在转染细胞中持续稳定表达,EGFP定点整合率约为4%,不经药物筛选大大提高了整合效率,比传统的基因打靶技术提高了4000多倍,为转基因动物研究建立了高效的定点转基因技术。
- 王克振蒋泓唐冬生曾芳梁沂梅李月琴周天鸿
- 关键词：基因打靶HEK293细胞
- 锌指核酸酶介导的高效多位点基因打靶被引量：4
- 2012年
- 该研究旨在建立锌指核酸酶介导的多位点基因打靶技术,为获得稳定遗传的转基因动物或基因治疗临床应用解决技术难题.首先利用OPEN平台设计、构建能识别人基因组内rDNA基因间隔序列的锌指蛋白基因序列,与FokⅠ的切割结构域连接、表达后获得锌指核酸酶基因,再构建锌指核酸酶真核表达载体.另外,构建含有2条同源重组引导序列和绿色荧光蛋白基因(EGFP)的多位点基因打靶载体.将锌指核酸酶真核表达载体和多位点基因打靶载体共转染HEK293细胞,内参对照PCR-灰度分析法检测外源基因定点整合效率,结果显示单独转染多位点基因打靶载体的定点整合效率为6.8%;而由于锌指核酸酶在染色质DNA上切割rDNA基因的间隔序列,诱导高效同源重组,锌指核酸酶载体、多位点基因打靶载体共转染的定点整合效率为24.2%,较常规基因打靶定点整合率(10-6～10-5)提高了24000多倍.共转染的HEK293细胞在无任何筛选的条件下持续培养2个月,经过20次传代之后,子代细胞能够持续表达EGFP,提示表达稳定.本研究建立了锌指核酸酶介导的高效多位点基因打靶技术,不仅大大提高了外源基因的定点整合效率,而且兼顾了基因表达的稳定性和安全性,为动物定点转基因和人类基因治疗提供了重要的技术平台,具有广泛的应用前景.
- 唐冬生蒋泓刘芳王克振张勇曾芳梁沂梅邓廷贤欧阳宏佳李月琴张细权周天鸿
- 关键词：锌指核酸酶基因打靶同源重组转基因动物基因治疗
