国家自然科学基金(30770106)
- 作品数：11 被引量：14H指数：3
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- 相关机构：暨南大学更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金广东省自然科学基金教育部科学技术研究重点项目更多>>
- 相关领域：生物学医药卫生更多>>
- 稳定表达人巨细胞病毒蛋白pUL23细胞系建立及其功能研究被引量：1
- 2010年
- 目的:建立稳定表达人巨细胞病毒UL23基因的HELF细胞系,研究病毒蛋白在宿主细胞内行为,为进一步研究人巨细胞病毒蛋白pUL23的功能提供依据。方法:通过PCR技术从人巨细胞病毒基因组中扩增出UL23基因,通过分子克隆技术构建重组逆转录病毒表达载体pLEGFP-N1-FLAG-UL23。将该载体导入Am-phoPackTM-293细胞,收获重组逆转录病毒,然后感染HELF细胞,HELF经持续G418抗性筛选后获得稳定表达UL23基因的细胞系。采用激光共聚焦显微镜观察病毒蛋白在细胞内的定位。结果:RT-PCR、Western blotting结果证实病毒基因UL23能够整合到宿主细胞基因组中,并能在宿主细胞中稳定表达病毒蛋白。共聚焦显微镜观察到病毒蛋白pUL23定位于细胞质,处于细胞核周边。结论:利用逆转录病毒载体介导的基因转移技术,成功构建了稳定表达UL23基因的转基因细胞系。该病毒蛋白在宿主细胞质中的定位,提示病毒蛋白发挥功能的空间位于细胞核周边,有利地推进了人巨细胞病毒蛋白pUL23功能研究的进程。
- 杨丹丽肖小平宫君原员月明李月琴张欣邹弈周天鸿李弘剑
- 关键词：巨细胞病毒逆转录病毒
- 酵母双杂交系统筛选与HCMV pUL23蛋白相互作用的蛋白质被引量：7
- 2009年
- 将UL23基因的ORF序列克隆到酵母表达载体pGBKT7构建诱饵质粒pGBKT7-UL23,用酵母双杂交技术筛选人胚肾cDNA文库中与人巨细胞病毒pUL23相互作用的宿主蛋白分子,再通过回复酵母双杂交再次确认两者之间的相互作用.结果表明:酵母双杂交,回复酵母双杂交试验证明宿主蛋白分子eIF3e(eukaryotic trans-lation initiation factor3,subunit E interacting protein)能够与人巨细胞病毒UL23蛋白相互作用.宿主蛋白分子eIF3e能够与人巨细胞病毒UL23蛋白相互作用,这为进一步研究pUL23蛋白在HCMV生活周期中的作用机制提供依据.
- 赵振岭李实骞姚火旺周天鸿李弘剑
- 关键词：人巨细胞病毒酵母双杂交蛋白质相互作用
- 基于Red重组系统构建含Flag标签标记UL23基因的重组人巨细胞病毒
- 2012年
- 利用来源于λ噬菌体的Red系统,将Flag标签及两侧带有FRT位点的卡那霉素抗性基因片段插入原HCMV TowneBAC中UL23基因3'末端区域,通过卡那抗性筛选带有抗性标记的重组菌株,并通过表达重组酶FLP的质粒pCP20去除卡那霉素抗性基因,得到带有Flag标签标记UL23基因和单一FRT位点的突变BAC。重组后的BAC分子同质粒pcDNA3.1(+)-pUL82共转染HFF细胞后重建重组HCMV。Western blotting检测证实所构建重组病毒能够表达含Flag标签标记的pUL23蛋白。此含有Flag标签标记UL23基因的重组HCMV的成功构建为了进一步研究人巨细胞病毒UL23基因及其产物的功能提供依据。
- 胡嘉淼肖静刘明亮曾宝娟李婧惠李继东周天鸿冉艳红李弘剑
- 关键词：RED同源重组
- 人β-酪蛋白GAS基序荧光素酶报告基因载体的构建与鉴定
- 2011年
- 构建人β-酪蛋白GAS基序荧光素酶报告基因表达载体。合成3个连续重复的人β-酪蛋白启动子中干扰素γ活化序列(gamma-activated sequence,GAS)并将其克隆至pGL3-Promoter荧光素酶报告基因载体。测序鉴定构建的载体,然后将其转染入人胚肺成纤维细胞(human embryonic lung fibroblasts,HELF)中检测荧光素酶的表达活性。测序结果表明,3×GAS序列正确;双报告基因系统检测荧光素酶活性表明,构建的报告基因具有启动子活性。成功构建的人β-酪蛋白GAS基序荧光素酶报告基因表达载体,为进一步研究干扰素γ诱导的JAK-STAT信号通路提供了必要的试验材料。
- 员月明李弘剑
- 关键词：Β-酪蛋白荧光素酶报告基因
- 人DNAJB6蛋白与人巨细胞病毒皮层蛋白pUL23相互作用的鉴定被引量：7
- 2009年
- pUL23是人巨细胞病毒(HCMV)UL23基因编码的皮层蛋白.HCMV皮层蛋白与病毒颗粒的形成、病毒转移、免疫调控等病毒生活过程相关.利用GAL4酵母双杂交系统筛选人胚肾cDNA文库,获得与人巨细胞病毒皮层蛋白pUL23相互作用的宿主蛋白分子DNAJB6[DnaJ(Hsp40)homolog,subfamily B,member 6].回复酵母双杂交、体外GST-Pull down和免疫共沉淀试验再次确认两者之间的相互作用.该结果为进一步研究pUL23蛋白在HCMV生活周期中的作用机制提供依据.
- 姚伙旺李实骞胡嘉淼陈业志邹奕张欣李月琴周天鸿李弘剑
- 关键词：人巨细胞病毒酵母双杂交蛋白质相互作用
- 稳定表达人巨细胞病毒pUL49蛋白人胚肺成纤维细胞系的建立
- 2010年
- 目的用逆转录病毒载体介导的基因转移方法,建立稳定表达人巨细胞病毒(HCMV)UL49基因的HELF细胞系。方法首先应用RT-PCR从感染HCMV的HELF细胞RNA中扩增UL49基因,克隆到逆转录病毒载体pLEGFP-N1上,以此构建重组逆转录病毒载体pLEGFP-N1-FLAG-UL49,并转染AmphoPack-TM-293细胞,收集逆转录病毒,感染HELF细胞,经G418抗性筛选出阳性细胞。结果经IFA、RT-PCR及Western blot检测到UL49基因在稳定细胞系中表达。结论 HELF-PLEGFP-N1-FLAG-UL49稳定细胞系构建成功。此细胞系为进一步研究HCMV pUL49蛋白的功能提供了一个有力工具。
- 宫君原肖小平员月明李月琴张欣邹弈李弘剑周天鸿
- 关键词：人巨细胞病毒逆转录病毒稳定细胞系
- 利用酵母双杂交系统筛选与人巨细胞病毒皮层蛋白pUL23相互作用的病毒编码蛋白被引量：3
- 2011年
- 人巨细胞病毒(HCMV)UL23基因编码病毒皮层蛋白,该基因缺失时,病毒在人包皮成纤维细胞(HFF)中的繁殖速度加快.为进一步阐述HCMV UL23基因编码产物pUL23的功能及调控机制,采用鸟枪法构建了融合于GAL4活性区域的HCMV Towne株基因组随机表达文库.利用酵母双杂交技术,以pGBKT7-UL23为诱饵质粒,从构建的HCMV基因组表达文库中筛选到与pUL23相互作用的病毒编码蛋白pUL24.GST-pull down实验和免疫共沉淀实验进一步确认两种病毒蛋白之间的相互作用.结果表明,构建的HCMV基因组表达文库能够用于GAL4酵母双杂交系统筛选与诱饵蛋白相互作用的病毒自身编码蛋白.病毒蛋白pUL23和pUL24之间具有相互作用,这为进一步阐述pUL23在HCMV感染过程中的功能提供依据.该研究为揭示HCMV病毒感染机制奠定了基础.
- 肖静胡嘉淼肖小平员月明刘明亮曾宝娟李婧惠周天鸿冉艳红李弘剑
- 关键词：人巨细胞病毒BAC基因组文库蛋白质相互作用
- ATPase抑制因子1是与HCMV pUL23蛋白相作用的宿主蛋白分子-酵母双杂交技术筛选与鉴定被引量：8
- 2009年
- 目的:利用酵母双杂交技术筛选与人巨细胞病毒相互作用的宿主蛋白分子,为探讨人巨细胞病毒pUL23蛋白在HCMV生活周期中的作用机制提供依据。方法:利用GAL4酵母双杂交系统筛选人胚肾cDNA文库,以获得与人巨细胞病毒pUL23蛋白相互作用的宿主蛋白分子,再通过回交试验和体外GST-pulldown试验验证两者之间的相互作用。结果:酵母双杂交筛选得到宿主蛋白分子ATPase inhibitory factor1(ATIF1),回交试验和体外GST-pulldown试验再次确认ATIF1能够与人巨细胞病毒pUL23蛋白相互作用。结论:pUL23确实能够与ATIF1相互作用,它们之间的相互作用可能为研究pUL23在病毒生活周期发挥的功能提供依据。
- 曾涛李实骞姚伙旺邹奕周天鸿李弘剑
- 关键词：巨细胞病毒
- 人巨细胞病毒编码蛋白pUL23在E.coliBL21(DE3)中的表达和纯化
- 2012年
- 大肠杆菌中高效表达携带组氨酸标签的人巨细胞病毒皮层蛋白pUL23,并进行纯化以及鉴定。提取感染HCMVTowne病毒株的HFF细胞的总RNA,逆转录为cDNA作为模板,经PCR获得UL23的基因片段,将此片段插入表达载体pET-28a(+),构建pET28a(+)-UL23重组质粒。将pET28a(+)-UL23转化至大肠杆菌BL21(DE3),进行IPTG诱导表达。表达产物经Western blotting分析后进行发酵,再用Ni sepharose亲和层析纯化,纯化产物进行SDS-PAGE和Western blotting检测。结果表明,成功构建pET28a(+)-UL23原核表达载体,表达及纯化了His-pUL23融合蛋白,为进一步研究pUL23奠定基础。
- 李婧惠刘明亮李继东张忠明冉艳红周天鸿李弘剑
- 关键词：人巨细胞病毒纯化组氨酸标签
- 人巨细胞病毒皮层蛋白pUL23与宿主蛋白IGFBP4相互作用的鉴定被引量：2
- 2010年
- 目的:利用蛋白质相互作用的技术筛选与pUL23相互作用宿主蛋白,为研究pUL23蛋白对人巨细胞病毒繁殖的影响提供线索。方法:通过酵母双杂交系统从人胚肾cDNA文库筛选与pUL23相互作用的宿主蛋白;通过GST-pu ll-down技术研究二者体外物理性相互作用;免疫共沉淀技术进一步研究二者在胞内相互作用。结果:Pu ll-down技术、免疫共沉淀技术确定了宿主蛋白IGFBP4与pUL23具有相互作用。结论:上述结果为研究pUL23蛋白调节病毒自身繁殖功能提供重要依据。
- 肖小平周天鸿宫君原杨丹丽员月明李月琴邹奕张欣李弘剑
- 关键词：人巨细胞病毒
