江西省自然科学基金(0340113)
- 作品数：3 被引量：1H指数：1
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- 首次应用反转录病毒仅感染分裂细胞特性构建hTERT驱动野生型p53基因反转录病毒载体质粒
- 2008年
- 目的:选择只感染分裂细胞的鼠源性反转录病毒载体pLHCX作为载体,构建由hTERT启动子驱动目的基因表达的载体,实现靶向性表达。方法:实验于2005-09/2006-05在江西省分子医学重点实验室完成。①实验材料:含319bp hTERT核心启动子的phTERT-luc质粒由军事科学院郑晓飞博士惠赠,反转录病毒载体质粒pLHCX由浙江大学朱永良教授惠赠,含1.8kb wtp53基因的质粒pCMV-Neo-BamH-wtp53由第二军医大学朱明华教授惠赠,增强型绿色荧光蛋白报告质粒pEGFP-N2和pEGFP-C1由本室保存,对照反转录病毒质粒pLHCX-CMV-EGFP前期构建完成;端粒酶阳性人大肠癌细胞SW620、HT-29,人宫颈癌细胞Hela,人肺癌细胞A549和端粒酶阴性人胚肺成纤维细胞MRC-5由本室保存。②实验方法:利用定向克隆的方法分别构建由hTERT启动子驱动EGFP的质粒pLHCX-hTERT-EGFP和驱动wtp53表达的质粒pLHCX-hTERT-wtp53。以质粒pLHCX-hTERT-EGFP和课题组前期构建的质粒pLHCX-CMV-EGFP转染端粒酶阳性的人大肠癌细胞株SW620和HT-29、人宫颈癌细胞株Hela和人肺癌细胞株A549以及端粒酶阴性的正常人肺胚成纤维细胞MRC-5。③实验评估:通过流式细胞仪测定分析转染效率,证实pLHCX-hTERT-EGFP在不同细胞中的表达特异性。运用RT-PCR和Western Blot分别检测p53mRNA和p53蛋白在p53突变的大肠癌细胞株SW620中表达。利用MTT检测质粒pLHCX-hTERT-wtp53对不同细胞的增殖抑制情况和流式细胞术检测不同细胞的凋亡情况。结果:①通过酶切证实重组质粒pLHCX-hTERT-EGFP和pLHCX-hTERT-wtp53构建成功,并通过将pLHCX-hTERT-EGFP转染SW620细胞观察到绿色荧光蛋白的表达,测序证实构建质粒中包含完整的wtp53片段。②流式细胞术检测结果证实质粒pLHCX-hTERT-EGFP处理后端粒酶阳性的SW620、Hela和A549内增强型绿色荧光蛋白表达强度明显强于端粒酶阴性的MRC-5(P<0.05),而pLHCX-CMV-EGFP在端粒阳性和阴性的上述细胞中表达无明显
- 余新洪葵邓俊晖刘天德雷钧张吉翔邵江华
- 关键词：野生型P53基因治疗
- hTERT基因启动子调控表达绿色荧光蛋白基因的逆转录病毒载体的构建及在人宫颈癌Hela细胞中的表达
- 2008年
- 目的探讨人端粒酶逆转录酶(humantelomerase reserved transcriptase,hTERT)基因启动子调控表达增强型绿色荧光蛋白基因(enhanced green fluorescence protein,EGFP)的逆转录病毒载体的构建及其在人宫颈癌Hela细胞中的表达。方法经SacI/BglⅡ双酶切phTERT-luc质粒,获得hTERT启动子的基因片段;定向连接到被SacI/BamHⅠ双酶切的pEGFP-N2质粒上,获得phTERT-EGFP-N2,并以其为模板,利用PCR技术,克隆出hTERT启动子和EGFP基因片段;再经EcoRI/BamHⅠ双酶切,定向插入到逆转录病毒plxsn的多克隆位点,再获得目的重组载体plxsn-hTERT-EGFP,并进行酶切鉴定,并将重组质粒转染人宫颈癌Hela细胞36 h后观察荧光表达情况。结果phTERT-EGFP-N2的构建与鉴定结果显示,phTERT-EGFP-N2构建成功。plxsn-hTER-T-EGFP的构建与鉴定结果显示,阳性重组质粒plxsn-hTERT-EGFP(7 023 bp)经EcoRI/BamHⅠ双酶切,获得1 165、5 858 bp 2片段;阴性重组质粒plxsn(5 874 bp)经EcoRI/BamHⅠ双酶切,获得16、5 858 bp 2片段;证实plxs-n-hTERT-EGFP构建成功。倒置荧光显微镜下观察结果显示,plxsn空载体及重组质粒plxsn-hTERT-EGFP转染Hela细胞,经plxsn空载体转染的Hela细胞不能观察到任何荧光;而经plxsn-hTERT-EGFP转染的Hela细胞可见到绿色荧光蛋白的表达。结论成功构建了hTERT基因启动子调控的表达绿色荧光蛋白基因的逆转录病毒载体并获得表达。
- 邓俊晖余新邵江华
- 关键词：绿色荧光蛋白逆转录病毒人宫颈癌HELA细胞
- 人端粒酶逆转录酶基因启动子在肿瘤靶向性基因治疗中的作用被引量：1
- 2007年
- 黄明文邵江华
- 关键词：HTERT启动子基因疗法靶向性
