国家自然科学基金(81271779)
- 作品数：11 被引量：24H指数：3
- 相关作者：方毅敏赖小敏申雁鸣姚亚男梅志雄更多>>
- 相关机构：广州市胸科医院中山大学中山大学附属第三医院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金艾滋病和病毒性肝炎等重大传染病防治专项广东省自然科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生更多>>
- 酶联免疫斑点法对抗结核治疗期肺结核患者多肽特异性IFN-γ的检测被引量：8
- 2013年
- 目的运用酶联免疫斑点法检测结核患者外周血IFN-γ,探讨结核患者结核多肽特异性IFN-γ分泌水平随抗结核治疗的变化。方法采用结核混合多肽E6+E7+C14、E6+E7作为刺激抗原,对331个处于治疗前或1、2、3、4、5和6个月治疗期的肺结核患者外周血标本进行多肽特异性IFN-γ酶联免疫斑点法(ELISPOT)检测。结果治疗前的肺结核患者其ELISPOT阳性检测率均高于痰涂片和痰培养阳性率(E6+E7+C14-ELISPOT92.5%、E6+E7-ELISPOT89.7%、痰涂片41.0%、痰培养59.0%),且差别均有统计学意义(P<0.010和P<0.001)。在抗结核治疗各个时期,肺结核患者IFN-γ-ELISPOT检测阳性率和斑点数(spotformingcells/106cells,SFP)随着治疗的进行持续下降,由治疗前高水平(E6+E7+C14-ELISPOT阳性率92.5%、SFP计数中值M=381;E6+E7-ELISPOT阳性率89.7%、SFP计数中值M=168)降至第6个月治疗结束时低水平(E6+E7+C14-ELISPOT43.6%、M=40;E6+E7-ELISPOT38.1%、M=36)。痰涂阳性患者的SFP计数持续处在高位,且治疗6个月痰涂阳性患者的SFP计数显著高于痰涂阴性患者。结论两种混合多肽IFN-γ-ELISPOT可提高结核患者的诊断率,同时检测抗结核治疗患者的IFN-γ分泌水平以监测抗结核治疗的效果。
- 林淑娴杨芳芳彭毅李研方毅敏黎意芬赖小敏
- 关键词：免疫酶技术抗结核治疗
- 不同等位基因E7/HLA-DR四聚体结合的结核患者CD4＋T细胞CDR3区序列分析被引量：2
- 2017年
- 目的 探讨机体抗结核免疫过程中CD4＋T细胞TCR与多肽/MHC之间的识别和结合规律.方法 从9例结核患者胸水中用等位基因不同的结核多肽E7/HLA-DR四聚体磁珠分选出E7结合阳性CD4＋T细胞,提取其RNA逆转录成cDNA作为模板扩增TCRα链和β链CDR3区核酸片段,并比较其长度和序列特征.结果 等位基因不同的E7/HLA-DR四聚体能够识别同一患者CDR3区序列相同或结构功能相似的CD4＋T细胞克隆.结论 结核患者体内CD4＋T细胞识别和结合抗原多肽时有一定的HLA-DR限制性,但是主要以多肽特异性为主,这为进一步探讨机体抗结核免疫中CD4＋T细胞和MHC之间的抗原提呈机制提供了数据.
- 甘一川王聪方毅敏姚亚男涂晓欣申雁鸣赖小敏
- 关键词：结核E7CD4+T细胞E7CDR3
- 结核病巨噬细胞极化的信号通路研究进展被引量：4
- 2017年
- 结核病是一种慢性传染性疾病,MTB为典型的胞内寄生菌,故细胞免疫在机体抗MTB感染过程中发挥主要作用.巨噬细胞作为吞噬MTB的主要细胞,可帮助机体控制MTB的感染[1].成熟的巨噬细胞在各种环境因素的诱导下分化成不同的细胞亚型,表达或分泌功能不同的表面分子及细胞因子,因此研究结核病巨噬细胞极化的分子通路有助于人们对结核病的发生、发展及预后进行深入研究,现将近年来该领域的研究进展综述如下.
- 孟慧杰谭守勇赖小敏
- 关键词：细胞极化结核病信号通路慢性传染性疾病MTB细胞免疫
- 应用CD4^+TCR四聚体-流式分析和细胞爬片法检测分析外周血结核抗原特异性CD14^+单核细胞
- 2014年
- 目的探讨CD4+TCR四聚体-流式分析和细胞爬片法检测分析外周血结核抗原特异性CD14+单核细胞的应用价值。方法应用四聚体对肺结核患者(肺结核组)外周血进行染色,流式检测四聚体阳性CD14+细胞的百分率,以非结核呼吸道感染患者(非结核呼吸道感染组)外周血及脐带血标本(脐带血组)作为研究对照。将肺结核组和对照组外周血制作成细胞爬片,用四聚体-细胞爬片法原位染色,激光共聚焦倒置显微镜观察细胞爬片中四聚体与结核抗原双染阳性及四聚体与CD14双染阳性细胞的分布情况。结果应用CD4+Vα21-J39/Vβ29-D1-J2 TCR四聚体检测肺结核组、非结核呼吸道感染组和脐带血组的四聚体阳性CD14+细胞百分率中位数分别为1.32%、0.50%和0.26%,而CD4+Vα21-J39/Vβ29-D2-J2 TCR四聚体则分别为1.05%、0.49%和0.19%。肺结核组外周血CD14+单核细胞百分率显著高于各对照组。细胞爬片法可观察到肺结核组四聚体与CD14双染阳性及四聚体与结核抗原双染阳性的细胞,而对照组标本均为阴性。结论 CD4+TCR四聚体技术,结合细胞流式和细胞爬片原位染色方法,能在体外敏感地检测出结核抗原特异性CD14+单核细胞,可以更准确地评价其在结核感染者体内的变化特征及临床意义。
- 吴荣顺赖小敏谢丹方毅敏张扣兴
- 关键词：CD4^+CD14^+单核细胞
- 结核特异性CD4^+ α/β TCR四聚体细胞株筛选技术的建立和应用被引量：1
- 2014年
- 目的应用不同的MTB多肽以及不同的HLA-DR基因构建的膜表面表达结核抗原肽/HLA-DR复合物的S2恒定细胞株,即人工APC筛选、鉴定结核特异性CD4+α/βTCR四聚体。方法以PE标记的CD4+α/βTCR四聚体、FITC标记的抗HLA-DR抗体(L243),分别与未诱导表达或CuSO4诱导表达后的膜表面表达结核抗原肽/HLA-DR的果蝇S2恒定细胞株,以及与无多肽或结合有结核多肽的、表达HLA-DR的S2细胞株共孵育,流式细胞技术检测分析TCR四聚体与各种细胞株结合率的差异。结果 TCR四聚体6M、6N均与2#细胞株,即C5/HLA-DRB1*0404(1.73%、5.93%)等具有较高的阳性结合率;结核抗原肽孵育后,一些人工APC的四聚体阳性结合率有所提高;所筛选的9个TCR四聚体均与2#细胞株有较高的结合率。结论膜表达结核抗原肽/HLA-DR的S2细胞株,可以应用于结核特异性CD4+α/βTCR四聚体的筛选、鉴定;构建的9个CD4+α/βTCR四聚体均为结核特异性。
- 姚亚男黄宇虹王娟陈伊任亮亮赖小敏
- 关键词：CD4+T细胞
- 表达结核特异性Vγ9Vδ2 TCR双链单体的果蝇 S2恒定细胞系的构建和鉴定被引量：2
- 2015年
- 目的：转染及筛选鉴定能够稳定表达和分泌Vγ9Vδ2 T细胞受体（TCR）双链单体的果蝇S2恒定细胞系。方法利用氯化钙转染法将TCR γ9-FB-pMT／V5-His B质粒、TCR δ2-JB-pMT／V5-His A质粒、pMT／Bip-BirA质粒和pCoHygro潮霉素质粒转染进S2细胞中，用潮霉素B筛选恒定细胞系后表达生物素化的结核特异性Vγ9Vδ2 TCR双链单体，并加以鉴定。结果斑点印迹试验、SDS-PAGE和Western blot表明细胞培养上清中有Vγ9Vδ2 TCR单体，且已被成功生物素化。结论成功筛选出能稳定分泌表达Vγ9Vδ2 TCR的果蝇S2恒定细胞系，为研究γδ T细胞的免疫识别提供实验资料。
- 涂晓欣张洁孟繁荣方毅敏杨芳芳赖小敏
- 结核分枝杆菌一特异性多肽E7诱导单核一巨噬细胞向M2型分化的信号通路被引量：1
- 2018年
- 目的探讨结核分枝杆菌(MTB)-特异性多肽E7诱导单核-巨噬细胞向M2型分化的信号通路。方法将相同个数的单核-巨噬细胞分为空白对照组、M1阳性组[用脂多糖及γ-干扰素(IFN-γ)共同刺激]、M2阳性组(用IL-4和IL-13共同刺激)和E7实验组(用MTB-特异性多肽E7刺激),分别于刺激后12、18、24和36h检测细胞的M1型标志物CD16、IL-6、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和M2型标志物CD163、CD206、IL-10的表达水平;用过氧化物酶体增殖剂激活受体-γ(PPAR-γ)阻断剂分别处理空白对照组、M2阳性组和E7实验组24h,检测各组在加入阻断剂前后PPAR-γ和CD163的表达情况,采用t检验对各组结果进行比较。结果与阳性组和空白对照组比较,E7实验组在刺激巨噬细胞至18h时,TNF-α的表达逐渐达到高峰(相对表达量为20.02),随后逐渐下降且伴随CD163表达逐渐升高,24h时CD163的表达至高峰(相对表达量为2.44);在加入阻断剂后E7实验刺激组的细胞PPAR-γ表达的量较阻断前明显降低(阻断前为0.94±0.06,阻断后为0.69±0.09,P=0.028);CD163的表达水平较阻断前明显下降(阻断前为3.95±0.61,阻断后为2.87±0.20,P=0.047)。结论MTB-特异性多肽E7可诱导单核-巨噬细胞向M2型分化,与PPAR-γ涉及的非受体酪氨酸激酶信号转导子和转录激活子信号通路相关。
- 孟慧杰王姣方毅敏申东梅毛玲邝浩斌覃红娟赖小敏谭守勇
- 关键词：分枝杆菌结核多肽类
- HMBPP/多肽E7对结核患者胸水及脐带血中γδT细胞分泌IL-6的影响
- 2020年
- 目的研究4-羟基-3-甲基-2-烯基焦磷酸(HMBPP)和多肽E7对结核患者胸水及脐带血中γδT细胞分泌白介素6(IL-6)的影响和机制。方法收集自广州市胸科医院临床诊断结核性胸膜炎患者胸水标本18例,自中山大学附属第三医院正常健康产妇脐带血标本17例。使用流式分选技术分选出结核性胸水和脐带血中的γδT细胞与CD277+CD14+单核-巨噬细胞混合培养,分别用HMBPP或E7刺激后,运用流式细胞术检测分泌IL-6的γδT细胞百分率及表达程序性死亡配体1(PD-L1)的CD277+CD14+单核-巨噬细胞百分率;利用RT-PCR技术检测细胞中IL-6、PD-L1的mRNA表达水平;用ELISA方法检测细胞培养上清中IL-6的含量;用PD-L1特异性小分子干扰RNA(siRNA)沉默PD-L1的表达以检测PD-L1是否参与分泌IL-6;在分选于结核性胸水和脐带血的共培养细胞中,HMBPP或E7刺激后上述指标在每一时间点对照组和实验组间分别采用独立样本t检验比较其差异,分析其统计学意义。结果在结核性胸水和脐带血中,给予HMBPP或E7刺激24 h之后,与对照组相比IL-6+γδ+T细胞占比显著升高,给予HMBPP或E7刺激12 h之后γδT细胞中IL-6在mRNA水平的相对表达量显著上调,以及在蛋白质水平的表达显著上调;在分选于脐带血的共培养细胞中,给予HMBPP或E7刺激,CD277+CD14+单核-巨噬细胞中PD-L1在mRNA水平的相对表达量显著上调[(3.70±0.33)vs(4.20±0.34)vs 1.00];在沉默PD-L1的表达后,γδT细胞中IL-6的表达显著降低[(0.53±0.03)vs(0.55±0.01)vs 1.00],差异均具有统计学意义(P均<0.05)。结论HMBPP和多肽E7能够促进CD277+CD14+单核-巨噬细胞PD-L1表达上调,后者参与刺激与其共培养的γδT细胞分泌更多的IL-6,这为γδT细胞的抗结核免疫机制的研究以及结核患者的免疫治疗提供依据。
- 常铸梅志雄方毅敏王姣黄明柳赖小敏
- 结核特异性多肽E6、E7和C14对单核-巨噬细胞亚型极化的影响被引量：4
- 2016年
- 目的运用流式细胞术检测单核-巨噬细胞极化亚型M1(CD14^+CD16^+)及M2(CD14^+CD163^+),探讨结核特异性多肽对单核-巨噬细胞极化分型的影响。方法以3种结核特异性多肽E6、E7和C14作为刺激物,刺激人急性白血病单核细胞株(THP-1细胞)、结核病患者胸水单个核细胞及外周血单个核细胞(PBMC),用流式细胞术检测刺激物不同时间点对单核-巨噬细胞极化表面标记表达的影响。结果结核特异性多肽E6刺激THP-1 24+0 h、24+24 h、24+48 h、24+72 h后,CD16/CD163阳性率分别为16.85%/13.78%、19.59%/15.68%、18.14%/14.19%、13.61%/11.47%。E7刺激效果与E6相似,C14对THP-1的CD16/CD163表达影响不如前两种多肽强。结核特异性多肽E6刺激结核患者胸水或血标本单核细胞19 h后,CD14+CD16+阳性率(1#患者:1.66%,2#患者:4.37%)与CD14^+CD163^+阳性率(1#患者:1.76%,2#患者:2.82%)差异不大,但CD14^+CD16^+CD86^+阳性率(1#患者:2.20%,2#患者:6.16%)大于CD14^+CD163^+CD206^+阳性率(1#患者:1.37%,2#患者:0.92%)。E7刺激效果与E6相似,C14对结核患者胸水或血标本单核细胞CD14/CD16/CD163表达影响不如前两种多肽强。结论 3种结核特异性多肽特别是E6、E7体外刺激单核细胞株THP-1、结核患者胸水或血标本单核细胞主要向M1型单核-巨噬细胞极化。
- 申东梅方毅敏申雁鸣刘国标姚亚男赖小敏
- 关键词：单核-巨噬细胞系统
- 利用γδ TCR四聚体检测分析外周血中CD14+CD277+单核-巨噬细胞的比例及其与治疗转归的关系被引量：1
- 2018年
- 目的 探讨外周血中CD14+单核-巨噬细胞在γδ T细胞识别磷酸化抗原中的作用及其与治疗转归的关系.方法 应用3种γδ TCR四聚体对肺结核患者外周血和新生儿脐带血单个核细胞进行流式染色,分析各类抗原提呈细胞( APC)所占比例,根据临床病例分析其与治疗转归的关系.结果 在结核患者外周血和脐带血中同时与CD277抗体、γδ TCR四聚体结合比例最大且结合力最强的细胞是CD14+单核-巨噬细胞,其百分率中位数( P50)值在抗结核治疗1个月时达到最高峰值,综合临床病症结果显示该时段患者病情明显好转.结论 CD14+单核-巨噬细胞在γδ T细胞识别磷酸化抗原的各类提呈细胞群中所占比例最大,为深入探讨γδ T细胞限制性识别磷酸化抗原机制及同时参与固有免疫与适应性免疫提供了实验资料.
- 毛玲梅志雄涂晓欣方毅敏甘一川申雁鸣赖小敏
- 关键词：转归
