国家高技术研究发展计划(2006AA100311)
- 作品数：17 被引量：150H指数：7
- 相关作者：蒋克勇刘梅王雷王宝杰姜珊更多>>
- 相关机构：中国科学院中国科学院研究生院山东省花生研究所更多>>
- 发文基金：国家高技术研究发展计划国家自然科学基金国家重点基础研究发展计划更多>>
- 相关领域：生物学农业科学环境科学与工程更多>>
- 凡纳滨对虾溶菌酶基因在毕赤酵母中的分泌表达和活性检测被引量：2
- 2010年
- 原核重组表达的凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)溶菌酶蛋白主要以包涵体形式存在,经变性和复性处理后活性仍较差。研究将凡纳滨对虾溶菌酶基因(Lvlyz基因)克隆至毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K中,电击转化毕赤酵母GS115细胞,经组氨酸营养缺陷培养基筛选和PCR检测获得转化子。对其进行连续甲醇诱导表达,利用SDS-PAGE和C端携带的6×His标签,对发酵液上清进行Western blot检测,结果表明19.3 kD左右的条带即是重组表达的溶菌酶蛋白。用溶壁微球菌平板抑菌法鉴定表达产物具有较强的抑菌能力。研究首次利用毕赤酵母真核表达系统实现对虾溶菌酶基因的可溶性表达,并且表达产物的活性良好。
- 卞曙光陈华新姜鹏张海波刘兆普秦松
- 关键词：凡纳滨对虾溶菌酶毕赤酵母分泌表达
- 中国明对虾组织蛋白酶L的原核重组表达及其组织分布被引量：7
- 2008年
- 组织蛋白酶L属于半胱氨酸蛋白酶中的木瓜蛋白酶超家族,在哺乳动物中它与抗原提呈、肿瘤入侵和转移、骨质吸收、细胞凋亡等许多生命活动有关。但对其在无脊椎动物中的功能了解的不多。从中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)中克隆得到了组织蛋白酶L基因,为了进一步研究组织蛋白酶L的组织分布及其功能,对该基因进行了重组表达。将中国明对虾组织蛋白酶L基因的酶原片段亚克隆进原核表达载体pET30a中,转化大肠杆菌BL21(DE3),再进行诱导表达,表达产物经SDS-PAGE电泳检测,其分子量在40kD左右,与期望的中国明对虾组织蛋白酶L的分子量一致。表达产物形成包涵体,经过对包涵体变性和复性,并进行His-tag柱亲和纯化,得到了纯化的蛋白。利用重组蛋白制备了的兔抗血清。Western实验表明,组织蛋白酶L在中国明对虾的肝、胃、肠中有表达,而在卵巢中没有表达。
- 卜兴江仉晓文孙允东赵小凡王金星
- 关键词：中国明对虾组织蛋白酶L
- 中国明对虾酚氧化酶原基因cDNA的克隆与表达特征被引量：14
- 2010年
- 利用3′和5′RACE技术从中国明对虾血细胞中克隆了一个酚氧化酶原基因FCproPO,FCproPO基因cDNA全长为2311bp,其中开放阅读框2061bp,编码687个氨基酸,预测分子量为78.71ku。推测的序列与凡纳滨对虾同源性为84%,与日本囊对虾同源性为71%。RT-PCR实验结果表明,FCproPO在血细胞中的相对表达量最高,在心脏和精巢中几乎不表达。序列分析发现FCproPO含有两个保守的铜离子结合位点;进化分析发现FCproPO与斑节对虾、日本囊对虾、凡纳滨对虾等海水虾的酚氧化酶原亲缘关系最近。该基因在被鳗弧菌和对虾白斑病毒(WSSV)感染后的对虾肝胰腺中的表达量显著增加,并具有不同的时空表达趋势,提示中国明对虾FCproPO基因在免疫反应中具有重要作用。
- 孙杰王宝杰李晓华孙姝娟刘梅蒋克勇王雷
- 关键词：中国明对虾酚氧化酶原基因克隆
- 大肠杆菌表达抗脂多糖因子的发酵条件优化被引量：2
- 2011年
- 抗脂多糖因子(anti-lipopolysaccharide factor,ALF)作为一种重要的抗菌肽,具有抗菌性强,抗菌谱广的特点。将中华绒螯蟹(Eriocheirsinensis)抗脂多糖因子基因ALF克隆至pET32a载体获得原核表达载体。为了提高ALF融合蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达量,保持抑菌活性,对已构建的重组大肠杆菌的发酵条件进行了优化,通过单因素分析的方法,考察了五种不同的培养基对表达量的影响,并在LB+M9培养基的基础上对培养基各组分进行了选择和优化,确定最佳培养基组分为:2.5 g/L蔗糖,10 g/L酵母膏,2.4 g/L(NH4)2SO4,12.8 g/L Na2HPO4,3 g/L KH2PO4,10.5 g/L NaCl,2 mmol/L MgSO4,0.1 mmol/L CaCl2溶液。分析了多种因素对表达量的影响,结果表明,培养基pH调至6.5,在菌体OD600达到0.8时加入诱导剂IPTG至终浓度为0.5 mmol/L,33℃继续诱导5 h,蛋白表达量最高。表达的融合蛋白可以抑制藤黄微球菌(Micrococ-cus luteus)在平板上的生长。
- 姜珊刘梅王宝杰蒋克勇王雷
- 关键词：大肠杆菌发酵条件
- 对虾病害防控的理论与实践被引量：5
- 2020年
- 近年来我国对虾养殖持续保持较高增长,但是高密度集约化养殖带来的病害频发和防控手段缺乏等问题,往往给对虾养殖业造成巨大损失,使对虾养殖业成为一个高风险高回报的产业。针对我国对虾养殖业存在的主要危害因子如病原微生物、真菌毒素和环境胁迫等,笔者所在研究团队多年来从对虾免疫反应和生长代谢调控角度,探讨了对虾应对外界刺激的内在机制。同时,研究开发了水产专用的微生物制剂、抗病功能蛋白以及生物饲料等新型的安全投入品,开展了从基础理论到实际应用的系统性研究工作。本文综述了研究团队多年来在对虾病害防控的理论与实践方面的研究成果。
- 刘梅王宝杰蒋克勇王雷
- 关键词：对虾天然免疫真菌毒素环境胁迫生物饲料
- 对虾抗菌肽转基因水稻抑制饲料腐败和防治罗非鱼细菌病害的初步研究被引量：4
- 2012年
- 探讨了以植物生物反应器开发利用抗菌肽类物质防治水产动物病害的效果和机理。以携带中国明对虾抗菌肽—对虾素3-2的转基因水稻米糠制作罗非鱼饲料,研究其对饲料腐败和吉富罗非鱼嗜水气单胞菌肠炎的抑制效果。通过测定米糠和饲料中的霉菌总数、细菌总数,发现水稻中表达的对虾素3-2能有效抑制饲料中的霉菌与细菌的繁殖,对于保持饲料品质具有显著的效果。选取规格一致、体质健壮的吉富罗非鱼,随机分成5组,每组3个重复,分别投喂含20%非转基因米糠的饲料与含不同质量比(10%、20%、30%)的转基因米糠的饲料。通过嗜水气单胞菌攻毒保护实验,结果发现,转基因米糠对罗非鱼嗜水气单胞菌肠炎具有显著的保护效果。对吉富罗非鱼的肠道主要微生物数量、中肠石蜡切片的进一步分析发现,摄食转基因米糠饲料组的罗非鱼肠道内大肠杆菌比例降低,乳酸菌比例提高,肠道微绒毛的结构完整性显著改善。由此推断抗菌肽转基因水稻的防病效果可能与肠道微生物的改变和对肠道结构的保护作用有关。但是石蜡切片发现过量添加转基因米糠(30%)也会导致吉富罗非鱼肠道上皮细胞损伤。
- 宫魁王雷付亚萍王宝杰刘文真蒋克勇刘梅
- 关键词：转基因水稻饲料吉富罗非鱼嗜水气单胞菌
- 中国明对虾过氧化物还原酶基因在大肠杆菌中的重组表达、产物纯化及活性测定被引量：2
- 2008年
- 采用RT-PCR扩增编码中国明对虾Prx成熟肽的基因,并克隆到大肠杆菌表达载体pCRT7/NT TOPO TA中进行体外重组表达。重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS后,经IPTG诱导表达产生包涵体形式的目的蛋白。对重组蛋白进行LC-ESI-MS分析,结果表明融合蛋白的4个肽段与中国明对虾Prx相应肽段完全一致。将重组蛋白通过金属螯合柱进行纯化,进而透析、复性,最后获得了具有较高过氧化物酶活性的重组Prx。
- 张庆利李富花张继泉蒋昊相建海
- 关键词：中国明对虾纯化活性
- 用于养殖环境调控的微生物制剂评价方法的研究被引量：7
- 2009年
- 为尝试建立对不同微生物制剂产品的客观评价方法体系,选择5种商品化复合微生物制剂,进行了菌数和主要组成种类等测定,并利用天然或人工模拟的养殖污水进行了不同微生物制剂对氨氮、亚硝酸态氮、COD等降解效果的比较,以及微生物制剂活化增效后的效果比较等。结果表明,不同的商业化复合微生物制剂在有益菌含量和水质污染降解效果方面存在较大差异。另外,微生物制剂在海水和淡水中以及是否经过活化,效果也存在较大差异。
- 王雷刘梅王宝杰蒋克勇彭虹旎万奎吉万乃宝
- 关键词：微生物制剂
- 日本囊对虾Kunitz型蛋白酶抑制剂在毕赤酵母中的表达纯化及活性分析被引量：2
- 2008年
- SKPI(shrimp Kunitz-type protease inhibitor)是日本囊对虾(Marsupenaeus japonicus)体内的一个小分子多肽,含有一个Kunitz型结构域,属于丝氨酸蛋白酶抑制剂。目前已知丝氨酸蛋白酶抑制剂在节肢动物免疫系统中起着非常重要的作用,为了了解SKPI在对虾天然免疫系统中的作用,首先对其进行了重组表达。从日本囊对虾肝胰腺中扩增skpi的cDNA片段,插入改造后的pPIC9K酵母表达载体,获得的重组质粒转化至毕赤酵母GS115进行表达。由于改造的pPIC9K载体加入了6-His标签,因此利用Ni Sepharose High Performance对SKPI进行了高效纯化。初步的活性研究表明,重组表达的SKPI能特异性地抑制胰蛋白酶的水解活性。
- 陈丹丹何南海张名昌
- 关键词：日本囊对虾毕赤酵母胰蛋白酶
- 凡纳滨对虾溶菌酶基因在大肠杆菌中的表达和活性检测被引量：13
- 2009年
- 将凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)血淋巴细胞中提取的总RNA,经RT-PCR扩增溶菌酶基因(LvLys基因)的开放阅读框,将其克隆至pMD18-T并测序。用限制性内切酶BamHⅠ和HindⅢ双酶切取目的基因并与表达载体pET-28a(+)连接,构建重组质粒pET-28(a+)/LvLys,转移到BL21(DE3)中诱导表达。经亲和纯化得到凡纳滨对虾重组溶菌酶。抑菌活性检测表明重组溶菌酶对大肠杆菌TOP10有一定抑制作用。
- 张海波谭洪新王兴强吴嘉敏秦松陈华新阎斌伦
- 关键词：溶菌酶基因原核表达
