国家教育部博士点基金(20050638033)
- 作品数：2 被引量：1H指数：1
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- 相关机构：西安交通大学医学院第一附属医院更多>>
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- 相关领域：医药卫生更多>>
- 沉默组织因子重组腺病毒的构建和胰岛中沉默效果检测被引量：1
- 2007年
- 目的构建复制缺陷型重组腺病毒介导短发夹RNA(shRNA)干扰组织因子(TF)在胰岛表达。方法设计并合成四对单链寡核苷酸(ss oligo),经变性退火为双链寡核苷酸(ds oligo)插入穿梭质粒pENTR/U6载体,测序正确后经脂质体介导入成人胰岛,通过实时定量RT-PCR方法筛选对TF沉默效果最佳穿梭质粒pENTR/U6-shRNA,然后与腺病毒骨架质粒行同源重组,筛选出正确重组子,用293A细胞包装出表达TF-shRNA的复制缺陷型重组腺病毒并测定其病毒滴度,通过实时定量RT-PCR腺病毒沉默TF效果予以检测。结果测序结果提示所构建的pENTR/U6-shRNA质粒正确,并从四对dsoligos筛选出对组织因子沉默效果最佳的穿梭质粒pENTR/U6-shRNA,经同源重组后成功构建了介导shRNA-TF复制缺陷型重组腺病毒。转染胰岛后,通过实时定量RT-PCR方法检测发现shRNA-TF腺病毒感染胰岛后对TF mRNA的沉默效果4d后达最佳效果,为54.29%(P<0.05vsNC)。结论成功构建的介导shRNA复制缺陷型重组腺病毒可以体外抑制胰岛细胞中组织因子的表达。
- 李钊伦薛武军田普训丁小明田晓辉冯新顺侯军
- 关键词：重组腺病毒胰岛基因沉默
- 共表达sCD40L-Ig和CTLA4-Ig双基因修饰原代人内皮细胞包被大鼠胰岛模型的建立
- 2008年
- 目的:建立以分离培养的原代人脐静脉内皮细胞包被大鼠胰岛细胞模型。方法:分离培养原代人脐静脉内皮细胞,并分别通过免疫组化试验检测人Ⅷ因子相关抗原,透射电镜观察Weible-palade小体,荧光显微镜观察DiI-Ac-LDL的吞噬效果,对所分离的人脐静脉内皮细胞进行鉴定。分离大鼠胰岛细胞,然后在肝素化培养皿中进行共表达sCD40L-Ig和CTLA4-Ig双基因的内皮细胞包被。对包被后的胰岛细胞进行形态学观察并检测其包被前后的功能。结果:分离培养的内皮细胞表达人Ⅷ因子相关抗原,电镜下可以观察到Weible-palade小体,荧光显微镜下可以观察到内皮细胞对DiI-Ac-LDL的吞噬。共表达sCD40L-Ig和CTLA4-Ig双基因的内皮细胞包被胰岛模型可以观察到内皮细胞的绿色荧光,未包被胰岛和内皮细胞包被胰岛的胰岛素释放指数分别为4.09和3.94,与未包被胰岛实验组相比,内皮细胞包被胰岛对高糖刺激反应无明显差异,但胰岛素释放量有所减少。结论:成功分离培养并鉴定了原代人脐静脉内皮细胞,并成功建立内皮细胞包被胰岛细胞模型,包被后胰岛功能正常。
- 李钊伦薛武军田普训刘华冯新顺丁小明
- 关键词：胰岛CTLA4-IG
