国家林业局948项目(2007-G57-C)
- 作品数：6 被引量：32H指数：4
- 相关作者：李刚李伟邱文英贾凤芹史利军更多>>
- 相关机构：中国农业科学院北京畜牧兽医研究所中国动物卫生与流行病学中心更多>>
- 发文基金：引进国际先进农业科技计划国家高技术研究发展计划“十一五”国家科技支撑计划更多>>
- 相关领域：农业科学医药卫生更多>>
- 小反刍兽疫病毒F蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备被引量：5
- 2012年
- 目的原核表达小反刍兽疫病毒(Peste des petits ruminants virus,PPRV)F蛋白,并制备多克隆抗体。方法根据GenBank中登录的PPRV Nigeria 75/1株F基因全长序列,采用DNAStar软件设计去除F基因信号肽和跨膜区的引物,进行RT-PCR扩增,并克隆至原核表达载体pET-32a(+)中,转化E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导表达。表达的重组蛋白纯化后,进行SDS-PAGE和Western blot分析,免疫BALB/c小鼠,制备多克隆抗体,并初步应用于PPRV的检测。结果重组原核表达质粒pET-32a(+)-PPRV-F经双酶切和测序证实构建正确;表达的重组F蛋白相对分子质量约59 000,诱导6 h表达量最高,且主要以包涵体形式表达;纯化的重组蛋白纯度可达95%以上;免疫小鼠制备的多抗能与纯化的重组蛋白发生特异性反应,抗体效价高于1∶64 000;间接免疫荧光试验显示,制备的多抗能够识别PPRV Nigeria 75/1株全病毒抗原。结论原核表达了PPRVF蛋白,并制备了高效价的多克隆抗体,为其进一步研究及小反刍兽疫临床快速检测方法的建立奠定了基础。
- 田康乐李刚邱文英程朝飞
- 关键词：小反刍兽疫病毒F蛋白原核细胞基因表达多克隆抗体
- 小反刍兽疫病毒H基因的原核表达与鉴定被引量：1
- 2009年
- 根据GenBank中已发表的小反刍兽疫病毒(PPRV)Nigeria75/1株的H基因序列,设计上下游引物并添加BamHⅠ酶切位点,以含有小反刍兽疫病毒H基因的Topo-PPRVH质粒为模板进行PCR扩增,扩增产物克隆于pEASY-T载体中,用BamHⅠ单酶切后将目的片段连接到原核表达载体pET-32a(+)中,核酸序列分析证明,成功构建了PPRVH原核表达质粒pET-32a-H。将pET-32a-H重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)进行融合表达,经SDS-PAGE电泳,可见H蛋白获得了高效表达,融合蛋白的分子量约为87ku,表达产物以包涵体的形式存在,其表达量达到菌体总蛋白的38%,占包涵体蛋白的80%以上。Western blot鉴定表明,所表达的重组蛋白能被抗组氨酸单抗、抗PPRV标准阳性羊血清及抗PPRV疫苗的羊血清所识别,具有良好的免疫原性。
- 李伟李刚邱文英贾凤芹曾妮吴素丽
- 关键词：小反刍兽疫病毒H基因原核表达
- 小反刍兽疫病毒间接ELISA抗体检测方法的建立与初步应用被引量：4
- 2009年
- 本研究利用原核表达的小反刍兽疫病毒核衣壳(N)蛋白作为标准抗原蛋白,建立PPRV抗体检测方法,同时对建立的检测方法的相关条件进行了优化。通过优化确定抗原的最佳包被浓度为10 mg/L,血清最佳稀释度为1∶40,二抗的使用浓度为1∶200,血清及二抗的最佳反应条件为37℃孵育60 min,底物的最佳反应时间为37℃15 min。通过批内及批间重复性的评价,变异系数均小于0.1,表明本检测方法具有较高的可重复性。经过临床样品检测证明,建立的检测方法可用于临床PPRV抗体的检测。
- 贾凤芹李刚李伟史利军胡小华
- 关键词：小反刍兽疫病毒N蛋白间接酶联免疫吸附试验
- 小反刍兽疫病毒N基因重组杆状病毒的构建及间接ELISA抗体检测方法的建立被引量：9
- 2010年
- 本研究旨在建立基于真核表达的小反刍兽疫病毒(PPRV)N蛋白的诊断小反刍兽疫的间接ELISA方法。利用Bac-to-Bac杆状病毒-昆虫表达系统,构建含有PPRV N基因的重组供体质粒pFastBacHTA-N,转化E.coliDH10Bac感受态细胞,得到重组穿梭质粒pBacmid-PPRV-V,转染昆虫细胞Sf21,获得含有PPRV N基因的重组杆状病毒。用重组病毒感染昆虫细胞后,SDS-PAGE鉴定出60ku左右的表达蛋白,Western blot检测该蛋白具有很好的反应原性。以重组Bacmid-PPRV-N蛋白作为包被抗原,建立间接ELISA检测方法。临床检测来自西藏疫区的37份山羊血清和来自青海省非疫区的92份山羊血清,与法国蒙彼利埃农学发展研究国际合作中心(CIRAD-EMVT)提供的竞争ELISA试剂盒相比较,特异性为96.2%,敏感性为100%,二者的符合率达到96.9%。结果表明本研究建立的间接ELISA方法可以很好地用于小反刍兽疫的临床诊断。
- 李伟李刚吴晓东邱文英张坤Hermann Unger
- 关键词：小反刍兽疫病毒杆状病毒昆虫细胞间接ELISA
- 检测猪圆环病毒2型抗体SPA胶体金免疫层析方法的建立被引量：11
- 2009年
- 采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒,并将其标记SPA,将金标SPA包被至玻璃纤维膜上,将猪圆环病毒2型(PCV-2)Cap蛋白、抗SPA抗体分别包被至硝酸纤维素膜的检测线与质控线上,建立了一种检测PCV-2抗体的胶体金免疫层析方法。检测阳性样品时,在检测线和质控线处均出现红色条带;检测阴性样品时,仅在质控线处出现红色条带。该方法与ELISA相比,其灵敏度为89.19%,特异性为100%,并且与PCV-1、猪瘟病毒(HCV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪细小病毒(PPV)阳性血清无交叉反应。
- 范晓娟李刚史利军张锦秀李伟
- 关键词：猪圆环病毒2型胶体金免疫层析抗体检测葡萄球菌蛋白A
