转基因生物新品种培育专项(2009ZX0810-002B)
- 作品数：3 被引量：9H指数：2
- 相关作者：范军程备久陈宗梅张宽亮亓振国更多>>
- 相关机构：安徽农业大学更多>>
- 发文基金：转基因生物新品种培育专项国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：生物学农业科学更多>>
- 玉米叶绿体铁氧还蛋白1的原核表达及部分性质分析被引量：1
- 2011年
- 叶绿体铁氧还蛋白(Fd)通过活性中心的铁硫簇传递还原力,在各种氧化还原途径中起重要作用。本研究中,氨基酸序列比对显示玉米中5种Fd的叶绿体导肽同源性很低,而去除导肽的成熟蛋白氨基酸序列具有很高的同源性。采用RT-PCR技术从玉米幼叶总RNA中克隆了编码成熟Fd1的基因,并分别插入pQE 80和p28SUMO表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3),表达的N端含有组氨酸标签的Fd1(His-Fd1),和含有组氨酸标签的小类泛素修饰蛋白(SUMO)的Fd1(HisSUMO-Fd1),用Ni-NTA层析介质亲和纯化,SDS-PAGE显示纯化的His-Fd1为一条带,亚基分子量约12kD。纯化的HisSUMO-Fd1用专一性蛋白酶Ulp除去HisSUMO,获得纯化的Fd1。紫外可见光谱扫描显示纯化的HisSUMO-Fd1溶液在315nm、415nm和459nm有特异吸收峰,电子顺磁共振波谱分析表明Fd1中存在[2Fe-2S]。SDS-PAGE显示多种玉米幼叶可溶性蛋白被固定化的His-Fd1吸附。
- 冯爱花陈宗梅李静程备久范军
- 关键词：纯化铁硫簇
- 表达大肠杆菌分子伴侣GroEL、GroES和GrpE载体的构建及其应用被引量：2
- 2012年
- 大肠杆菌(Escherichia coli)共表达系统常要求质粒具有不同抗生素抗性以及不同的复制子。利用粘性末端PCR技术,以含有大肠杆菌分子伴侣基因GroEL、GroES和GrpE的pR-GESP质粒为模板,设计两对引物,通过两次独立的PCR反应扩增3个基因的多顺反子,将形成粘性末端的PCR产物插入NcoI和XhoI酶切的pACYCDuet-1质粒,构建的pA-GESP质粒具有p15A复制子及氯霉素抗性,和具有ColE1复制子及卡那霉素抗性表达载体pET28b相容。SDS-PACE显示含有pA-GESP质粒的大肠杆菌细胞中3个分子伴侣蛋白的表达水平和含有pR-GESP质粒的大肠杆菌细胞没有明显差异,它们对玉米丝氨酸消旋酶的可溶性表达有部分促进作用,但对N端含有组氨酸标签的玉米铁氧还蛋白还原酶的表达没有作用,在三个含有不同抗生素基因的质粒中共表达分子伴侣、5-氨基乙酰丙酸合酶和尿卟啉原Ⅲ甲基化酶,两个酶连续催化的荧光产物在细胞内积累量为562.13±3.17/OD_(600),而没有分子伴侣的积累量为457.66±4.98/OD_(600),表明分子伴侣改善部分蛋白在大肠杆菌的可溶性表达和催化功能。
- 许鹏王蕾蕾程备久范军
- 关键词：分子伴侣大肠杆菌
