中国博士后科学基金(2004035634)
- 作品数：4 被引量：18H指数：2
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- 转化生长因子β_1不同作用时间对体外培养小鼠失神经骨骼肌肌源性干细胞内结缔组织生长因子的影响被引量：6
- 2007年
- 目的观察转化生长因子β1(transforming growth factor β1,TGF-β1)对失神经骨骼肌肌源性干细胞(muscle derived stem cell,MDSC)内结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)的影响,探讨TGF-β1-CTGF通路致失神经骨骼肌纤维化的作用及机制。方法采用差速贴壁法分离培养并鉴定小鼠失神经骨骼肌MDSC,用浓度为10ng/ml的TGF-β1培养24h前、后分别作表型鉴定。体外MDSC分别在TGF-β1浓度为10ng/ml的培养基内培养0、3、6、12、24和48h,按时间点分为A^F组,Western blot检测CTGF蛋白表达,实时荧光定量RT-PCR检测CTGF mRNA水平。结果免疫组织化学观察示,加入TGF-β1干预前MDSC高度表达Sca-1,阳性率96%;TGF-β1干预后Sca-1表达阳性率明显降低,阴性率>99%。Western blot检测A^F组CTGF与β-actin的平均吸光度(A)值比值分别为0.788±0.123、1.063±0.143、2.154±0.153、2.997±0.136、3.796±0.153和3.802±0.175,A^D组间两两比较差异均有统计学意义(P<0.05),D^F组间两两比较差异无统计学意义(P>0.05)。A^F组RT-PCR的Ct值分别为1.659±0.215、1.897±0.134、2.188±0.259、2.814±0.263、2.903±0.126和3.101±0.186,A^D组组间比较差异有统计学意义(P<0.05),E组和F组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论TGF-β1能促进体外培养小鼠MDSC生成CTGF,在3~12h时间范围内呈时间依赖关系。
- 聂铭博陈振兵洪光祥
- 关键词：转化生长因子Β1肌源性干细胞结缔组织生长因子
- 胰岛素样生长因子1基因转染肌源性干细胞及表达
- 2007年
- 目的检测胰岛素样生长因子1(IGF-1)转染肌源性干细胞效果及IGF-1基因表达情况。方法取失神经骨骼肌,分离、接种培养肌源性干细胞。取第3代细胞,用Lipofectamine介导,将重组质粒PAD-CMV-IGF-1转染肌源性干细胞。荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达,酶联免疫吸附试验检测培养上清液中IGF-1的浓度变化,Western blot及实时荧光定量RT-PCR检测细胞内IGF-1及其mRNA的表达,流式细胞仪检测细胞周期。结果在转染2周内细胞表达绿色荧光蛋白。转染后上清液中分泌IGF-1浓度上升,72 h达到高峰为(32.2±5.3)ng/ml,后其浓度逐渐下降。Western blot证实有与IGF-1大小相符条带出现。实时荧光定量RT-PCR证实mRNA表达明显增高,第3天达到高峰。流式细胞检测表明转染后肌源性于细胞S期比例增加。结论PAD-CMV-IGF-1质粒可有效转染肌源性干细胞。
- 陈振兵聂铭博洪光祥陈颜花郑怀远康皓黄启顺翁雨雄
- 关键词：胰岛素样生长因子-1肌源性干细胞基因转染
- 差速贴壁法体外培养失神经骨骼肌肌源性干细胞的生物学特性被引量：12
- 2006年
- 目的:探讨失神经过程中的肌源性干细胞的生物学特性,掌握其分离、培养及鉴定方法,了解其生长规律并进行体内定位。方法:实验于2004-01/2005-10华中科技大学同济医学院附属协和医院手外科完成。选取清洁级3周龄昆明种小鼠5只,切断小鼠双侧坐骨神经,造成失神经损伤模型。采用XI型胶原酶和胰蛋白酶消化法及差速贴壁法分离细胞获取小鼠肌源性干细胞,进行体外原代和传代培养。观察细胞的形态,通过生长曲线分析肌源性干细胞的增殖能力,利用免疫细胞化学染色对所获得的细胞进行鉴定。结果:①失神经骨骼肌内肌源性干细胞生长特性:失神经骨骼肌肌源性干细胞原代培养时细胞贴壁及生长较慢,1个月后才进行传代。传代培养3d后部分细胞呈梭形,成簇状生长。7～10d后大部分为梭形和多形状,细胞间相互出现成片融合,此后细胞生长速度放慢。②失神经骨骼肌肌源性干细胞生长曲线的绘制:细胞培养前3d细胞生长慢,3d后生长明显加快,7d后生长明显放慢,进入平台期。③失神经骨骼肌内肌源性干细胞的表型鉴定:细胞质CD34和Sca-1染色均呈阳性,细胞核大。④失神经骨骼肌内肌源性干细胞的体内定位:CD34和Sca-1阳性细胞位于肌细胞和基底膜之间,细胞小,细胞数量较少。结论:采用差速贴壁法可从失神经骨骼肌内分离出肌源性干细胞,体外培养的肌源性干细胞具有良好的增殖能力,适用于组织工程和基因治疗。
- 陈振兵洪光祥陈燕花郑怀远康皓黄启顺翁雨雄
- 关键词：干细胞表型
- 转化生长因子β1对小鼠失神经骨骼肌肌源性干细胞内结缔组织生长因子合成的影响:量效与时效性分析被引量：1
- 2007年
- 目的:观察不同质量浓度转化生长因子β1作用于体外培养小鼠失神经骨骼肌肌源性干细胞后,细胞内结缔组织生长因子生成的变化。方法:实验于2006-03/06在武汉协和医院中心实验室完成。实验材料:清洁级3周龄昆明种小鼠由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供(动物使用许可证:syxk(鄂)2004-0028)。实验方法:采用差速贴壁法分离培养并鉴定小鼠失神经骨骼肌肌源性干细胞。取第2代肌源性干细胞,均匀加入6孔培养板中,每孔细胞数为104,置于37℃、体积分数为0.05的CO2培养箱中培养2d后,更换培养液。A～F组每孔加入含有质量浓度0,1,5,10,20,40μg/L重组人转化生长因子β1的含体积分数为0.2胎牛血清的DMEM培养基后,置于37℃、体积分数为0.05的CO2培养箱中培养3d。G～L组每孔分别加入含有质量浓度为10μg/L重组人转化生长因子β1的含体积分数为0.2胎牛血清的DMEM培养基后,同样条件培养箱中培养0,3,6,12,24,48h。实时荧光定量RT-PCR检测结缔组织生长因子mRNA水平,应用Westernblot检测结缔组织生长因子蛋白表达变化。结果:①Western blot检测结缔组织生长因子蛋白:可见阳性条带。A～D组平均吸光度比值随转化生长因子β1质量浓度增加而上升,组间差异具有显著性意义(0.854±0.157,1.203±0.144,2.471±0.141,3.652±0.202,P<0.05),D～F组上升曲线趋于平缓,组间差异无显著性意义(3.652±0.202,3.736±0.216,3.919±0.226,P>0.05)。G～J组平均吸光度比值随转化生长因子β1质量浓度增加而上升,组间差异具有显著性意义(0.788±0.123,1.063±0.143,2.154±0.153,2.997±0.136,P<0.05),J～L组上升曲线趋于平缓,组间差异无显著性意义。②RT-PCR检测结缔组织生长因子mRNA水平:A～D组结缔组织生长因子mRNA扩增量明显随转化生长因子β1质量浓度升高而上升,差异具有显著性意义(1.713±0.123,1.992±0.143,2.237±0.153,2.859±0.136,P<0.05),E、F组间差异无�
- 聂铭博陈振兵洪光祥
- 关键词：转化生长因子Β1肌源性干细胞结缔组织生长因子
